伯豪客戶發(fā)表胃癌研究新成果提出胃致癌過(guò)程新見(jiàn)解

瀏覽次數(shù)：2091　發(fā)布日期：2015-10-21　來(lái)源：本站　本站原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處

在胃癌（GC）發(fā)生過(guò)程中，DAN甲基化轉(zhuǎn)移酶3A的功能作用機(jī)制目前還不是很清楚。在該研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)的DNMT3A通過(guò)打亂G1/S的轉(zhuǎn)換而促進(jìn)肝癌的細(xì)胞增殖。同時(shí)該研究找到了DNMT3A的下游靶基因p18INK4C，異位表達(dá)DNMT3A在轉(zhuǎn)錄層次抑制了p18INK4C的表達(dá)水平。在GC細(xì)胞中減弱p18INK4C的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期過(guò)程，在DNMT3A過(guò)表達(dá)細(xì)胞中重表達(dá)p18INK4C可減弱G1/S的轉(zhuǎn)換。深入研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A通過(guò)直接調(diào)控p18INK4C啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度來(lái)影響其表達(dá)。臨床GC樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中p18INK4C的甲基化水平明顯高于配對(duì)癌旁組織，DNMT3A的表達(dá)水平與p18INK4C的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提出了胃致癌過(guò)程的新的見(jiàn)解，也為胃癌治療提供了潛在的靶標(biāo)。該研究中DNMT3A下游靶基因篩選表達(dá)譜芯片Affymetrix HTA2.0由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

研究背景：

在腫瘤發(fā)生的早期過(guò)程中，表觀遺傳調(diào)控機(jī)制——DNA甲基化起著非常重要的作用。真核細(xì)胞表達(dá)3個(gè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，已有研究發(fā)現(xiàn)DNMT1和DNMT3B在腫瘤的起始和發(fā)展階段發(fā)揮著重要作用，但是，對(duì)于DNMT3A在腫瘤中的功能作用機(jī)制還不是很清楚。

胃癌在世界范圍內(nèi)，尤其是在中國(guó)，是一種最常見(jiàn)的高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一。有研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A在多種腫瘤（包括胃癌）中表達(dá)異常。在胃癌中，尤其是DNMT3A的表達(dá)明顯比DNMT1和DNMT3B高。最近的研究也發(fā)現(xiàn)在胃癌病人中，只有DNMT3A的高表達(dá)伴隨著差的總體生存率。這些發(fā)現(xiàn)預(yù)示著，在胃癌中，DNMT3A可能扮演著非常重要的角色。因此，深入研究胃癌發(fā)生過(guò)程中DNMT3A的功能作用機(jī)制顯得尤為重要。

研究思路：

研究結(jié)果：

1. DNMT3A對(duì)GC細(xì)胞的增殖非常重要

首先，研究人員對(duì)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和BGC-823進(jìn)行了DNMT3A基因的敲降（AGS-shDNTM3A和 BGC-shDNTM3A），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著降低，foci formation形成頻率也降低。當(dāng)檢測(cè)外源過(guò)量表達(dá)DNMT3A細(xì)胞系MKN45時(shí)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)速率顯著增加。在裸鼠中移植AGS-shDNTM3A和 BGC-shDNTM3A細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯比對(duì)照小。這些結(jié)果表明DNMT3A對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖是必需的。

2. DNMA3A通過(guò)打亂G1/S的轉(zhuǎn)換促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)紊亂通常與細(xì)胞周期過(guò)程的加快相關(guān)。同樣處于G1期（72%）的AGS-shDNTM3A和對(duì)照釋放12h后，敲降組中處于G1期的細(xì)胞比率明顯高于對(duì)照。在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MKN45和BGC-823中得到了相反的結(jié)果。為了探究該現(xiàn)象的內(nèi)在分子機(jī)制，研究人員對(duì)敲降和過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中的7個(gè)G1/S轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)cyclinD1, CDK4 和CDK6在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中表達(dá)增加，敲降細(xì)胞系表達(dá)降低。這些結(jié)果表明DNMT3A通過(guò)破壞G1/S的轉(zhuǎn)換刺激細(xì)胞周期過(guò)程的發(fā)生。

3. DNMT3A下游靶基因鑒定

為了深入研究DNMT3A調(diào)控胃癌細(xì)胞周期過(guò)程的作用機(jī)制，研究人員進(jìn)行了下游調(diào)控基因篩選。通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系表達(dá)譜芯片（HTA2.0）檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，有558個(gè)下調(diào)和348個(gè)上調(diào)基因。GO分析發(fā)現(xiàn)主要的分子功能涉及結(jié)合與催化活性功能，生物學(xué)過(guò)程涉及細(xì)胞增殖，細(xì)胞粘附，細(xì)胞周期過(guò)程等，暗示著DNMT3A可能通過(guò)這些過(guò)程影響致癌。

（a）表達(dá)譜芯片篩選差異基因GO分子功能分析結(jié)果；

（b）表達(dá)譜芯片篩選差異基因GO生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果。

在其中有5個(gè)下調(diào)基因與細(xì)胞周期過(guò)程相關(guān)：BLM, CDKN1B, CCNE2,p18INK4C和CKS1B，他們與CDK的活性調(diào)控關(guān)系密切。qRT-PCR結(jié)果驗(yàn)證表明DNMT3A抑制了p18INK4C表達(dá)，當(dāng)在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系MKN45-DNMT3A中加入DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-Aza）后，p18INK4C的表達(dá)異常得到恢復(fù)。這些結(jié)果表明p18INK4C是DNMT3A的主要下游靶基因。

4. p18INK4C涉及DNMT3A調(diào)控的G1/S轉(zhuǎn)換

流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞中敲降p18INK4C可以增加G1/S轉(zhuǎn)換的細(xì)胞數(shù)量。Western blot分析顯示，CDK4和CDK6的蛋白表達(dá)增加。當(dāng)在DNMT3A過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中重表達(dá)p18INK4C后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢，G1期的細(xì)胞比率恢復(fù)。異位表達(dá)p18INK4C可以抑制CDK4和CDK6的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明p18INK4C參與DNMT3A誘導(dǎo)的G1/S轉(zhuǎn)換。

5. DNMT3A通過(guò)DNA甲基化抑制p18INK4C的表達(dá)

DNMT3A敲降細(xì)胞系BGS檢測(cè)p18INK4C啟動(dòng)子區(qū)CpG island區(qū)域，發(fā)現(xiàn)甲基化程度明顯低于對(duì)照。ChIP實(shí)驗(yàn)表明DNMT3A可結(jié)合到p18INK4C啟動(dòng)子的CpG island區(qū)域。這些結(jié)果表明DNMT3A可以直接結(jié)合到p18INK4C啟動(dòng)子區(qū)的CpG island區(qū)域影響其甲基化程度。

6. 臨床GC樣本中p18INK4C甲基化程度異常

25對(duì)臨床GC樣本和癌旁樣本檢測(cè)p18INK4C啟動(dòng)子區(qū)的25個(gè)CpG位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)癌組織中甲基化水平明顯高于癌旁，p18INK4C的mRNA水平也顯著降低。

7. 臨床GC樣本中DNMT3A與p18INK4C表達(dá)相關(guān)

35對(duì)臨床GC樣本和癌旁樣本檢測(cè)DNMT3A表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有22個(gè)（63%）中蛋白表達(dá)升高，并且與臨床病理指標(biāo)一致。qRT-PCR檢測(cè)p18INK4CmRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)其與DNMT3A蛋白表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。

該研究中DNMT3A下游靶基因篩選表達(dá)譜芯片Affymetrix HTA2.0由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

原文出處: Cui H, Zhao C, Gong P, Wang L, Wu H, Zhang K, Zhou R, Wang L, Zhang T, Zhong S, Fan H. DNA methyltransferase 3A promotes cell proliferation by silencing CDK inhibitor p18INK4C in gastric carcinogenesis. Sci Rep. 2015; 5: 13781.

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