賽默飛推出新品Q Exactive UHMR 高分辨質(zhì)譜儀

 
質(zhì)譜儀器作為一種質(zhì)量檢測儀器，被應(yīng)用到各個學(xué)科領(lǐng)域中，尤其是在化學(xué)化工、環(huán)境能源、醫(yī)藥、生命及材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在常規(guī)質(zhì)譜分析中，被分析物質(zhì)首先被離子化，隨后各種離子被引入真空中的質(zhì)量分析器，在分析器中的電場或磁場作用下，離子的運動特性隨其質(zhì)荷比不同而產(chǎn)生差異，因而造成時空上的分離，并由檢測器依次檢測出來。而在這種原理下，質(zhì)譜儀測量的是離子的質(zhì)荷比（m/z)，而不是質(zhì)量本身。
   
利用質(zhì)譜儀器對樣品的分析過程中，樣品的霧化過程十分關(guān)鍵。目前，常用的電噴霧技術(shù)原理是由John Fenn提出的電噴霧電離（ESI）技術(shù)，這一理論也獲得了2002年的諾貝爾化學(xué)獎。通常對蛋白質(zhì)這種大分子來說，ESI質(zhì)譜中都會呈現(xiàn)多種價態(tài)的譜峰群，群落中的每一組為某個電荷態(tài)該蛋白質(zhì)的各個同位素峰、鹽峰以及加合物峰等。由于電荷態(tài)z通常是連續(xù)的整數(shù)分布（例如z = 11，12....21,22...)，人們可以通過計算不同電荷數(shù)對應(yīng)的群落m/z的間隔來推算各組的電荷數(shù)z，進而求出實際的質(zhì)量m的分布，也可以使用軟件進行解卷積得到m分布。這種分析手段對于分析分子量較�。ǚ肿恿吭�5萬以下）、簡單純凈的蛋白樣品還是很有效的。 
 
然而，在實際應(yīng)用中對天然蛋白和病毒顆粒的分析卻不那么簡單。隨著分子量上升，分子結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，各種翻譯后修飾使被測蛋白的分子量出現(xiàn)差異化，很寬的質(zhì)量分布（可達上千Da）使得不同價態(tài)的峰群連接在一起。如圖1所示，這種缺少電荷狀態(tài)以及同位素峰的“死亡駝峰”，我們很難通過解卷積的形式進行分析。
   
并且，對于很多糖蛋白，分子量超過3、4萬就出現(xiàn)峰群交疊，無法用解卷積軟件來獲得分子量的分布信息。因此，對于大生物分子的質(zhì)譜分析，僅靠提高儀器的分辨率是無濟于事的。在這種情況下，電荷檢測質(zhì)譜（CDMS）技術(shù)便成為了我們的“救命稻草”。
   
電荷檢測質(zhì)譜（CDMS）通過同時測量單個離子的質(zhì)荷比和電荷數(shù)，進而計算獲得離子質(zhì)量m。

因此，相較于其他類型質(zhì)譜，CDMS技術(shù)的關(guān)鍵是如何準(zhǔn)確地測量單個離子的電荷。目前，電荷檢測質(zhì)譜技術(shù)還沒有現(xiàn)成的商品化儀器，只有能夠自己開發(fā)質(zhì)譜儀器硬件，或自己改編FTMS軟件的專家才能進行這樣的實驗。而在今年的ASMS會議上，賽默飛公司重磅推出了直接分析質(zhì)譜技術(shù)（DMT），并將其結(jié)合在了Orbitrap上，這使得超大分子量的復(fù)雜蛋白的直接質(zhì)譜檢測成為了可能。
   
直接分析質(zhì)譜技術(shù)其原理是：在Orbitrap中檢測來自離子沿中心電極的中心軸旋轉(zhuǎn)的軸向頻率，進而確定離子的m/z信息；與此同時，來自外電極上的感應(yīng)電荷振幅也會被檢測，從而確定離子的電荷z的信息。
   
直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式為 Orbitrap 質(zhì)量分析儀增加了電荷檢測功能，能夠同時測量數(shù)百個單個離子的質(zhì)荷比 (m/z) 和電荷數(shù) (z)。這使得 Orbitrap 質(zhì)量分析儀可以直接計算分析物的質(zhì)量，而不需要根據(jù) m/z 去卷積。根據(jù) m/z 去卷積的方法依賴于測量結(jié)果中已分辨的電荷狀態(tài)和/或同位素分辨的信號。直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式提高了分辨率，并且擴展了動態(tài)范圍，提高了可獲得的質(zhì)量測量結(jié)果的上限，同時由于單個離子測量的靈敏度較高，可以從濃度明顯較低的樣品中采集到更有價值的數(shù)據(jù)。
   
作為第一個商業(yè)化的電荷檢測質(zhì)譜儀，Q Exactive UHMR質(zhì)譜儀不僅配備了直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式，而且還擁有適合大蛋白分析的性能參數(shù)（圖3），例如掃描范圍350-80000，四極桿隔離高達 m/z 25,000，還同時具備源內(nèi)捕獲, Source CID, HCD 等多種碎裂模式。
 
 
基于此，我們提供了端到端的工作流程（圖4），適用于數(shù)據(jù)采集、處理和解讀以前難以分析的靶點。這大大降低了我們在實際使用過程中的難度。
 
   
01 穩(wěn)健地表征復(fù)雜的異質(zhì)非變性蛋白質(zhì)
 
高異質(zhì)性蛋白質(zhì)復(fù)合體的非變性質(zhì)譜表征對于理解生物進程和開發(fā)下一代生物治療藥物至關(guān)重要。將傳統(tǒng)的非變性質(zhì)譜技術(shù)與僅測量 m/z 的集成測量結(jié)合使用時，由殘余溶劑、離子加合物和翻譯后修飾引起的電荷態(tài)分布的重疊某種程度上提高了復(fù)雜性，往往使得譜圖難以解卷積。
 
直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式克服了這些挑戰(zhàn)，能夠?qū)δさ鞍踪|(zhì)、大型非共價蛋白質(zhì)復(fù)合體、糖蛋白以及高度異質(zhì)性的基于蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)的治療藥物進行詳細表征，并且提高了分辨率、靈敏度和動態(tài)范圍。
 
如糖蛋白，它在許多生理機能和某些疾病的進展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。由于存在異質(zhì)性，使用傳統(tǒng)的、完整的、自上而下的質(zhì)譜方法進行糖蛋白表征，這對研究人員來說是極其復(fù)雜的質(zhì)譜挑戰(zhàn)。此外，非變性質(zhì)譜的糖型檢測也受到空間分辨率和動態(tài)范圍的限制。而直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式通過提高分辨率、拓展動態(tài)范圍，開啟了多種全新的可能，能夠準(zhǔn)確、高效、詳細地鑒定各種糖型。
 
下圖5所示就是對人胎球蛋白 A上的糖基化鑒定。由于人胎球蛋白 A有兩個 N- 糖基化位點；最多七個 O- 糖基化位點；七個磷酸化位點；六個二硫鍵以及多種序列變體，使得直接質(zhì)譜分析十分困難。而使用具備直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式的 Q Exactive UHMR質(zhì)譜儀，則可以獲得完整胎球蛋白 A 的更全面的糖型譜圖（圖5）。
 

02 以超高的靈敏度篩查和表征膜蛋白質(zhì)
 
膜蛋白質(zhì)及其復(fù)合體負責(zé)不同的生物機能，因此是特別常見的藥物靶點，但由于其樣品制備要求較高，其分析可能會充滿挑戰(zhàn)。通過并行單個離子測量，直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式提供了更高的靈敏度和分辨率，可以將樣品稀釋數(shù)百倍，以便使用微量的珍貴樣品，單次運行即可實現(xiàn)樣品表征。現(xiàn)在有可能以前所未有的靈敏度對非變性膜蛋白質(zhì)進行篩選、雜質(zhì)鑒定和同位素分辨表征，包括蛋白質(zhì)變體和配體結(jié)合。
 
 
大腸桿菌水通道蛋白 Aquaporin Z（AqpZ） 是一個約為 99 kDa 的膜蛋白，由四個亞基組成。使用具備直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式的 Q Exactive UHMR質(zhì)譜儀對 AqpZ 進行非變性質(zhì)譜分析，在高能源內(nèi)捕獲設(shè)置下注入單體，揭示了 AqpZ 在單體和四聚體形式中的兩種主要分布情況（上圖）。將此譜圖轉(zhuǎn)換為質(zhì)量域，這也顯示了樣品的雜質(zhì)（中間）。用低分辨率進一步分析四聚體的峰值，結(jié)果表明出現(xiàn)了 28 Da變化的修飾（左下），或者高分辨率可以對質(zhì)量域中的四聚體復(fù)合體蛋白變體進行同位素解析（右下）。
 
03 復(fù)雜性蛋白質(zhì)形態(tài)的表征
 
對于復(fù)雜生物治療藥物的分子，傳統(tǒng)方法下我們無法對復(fù)雜的生物治療藥物進行全面的表征分析，或只能進行非常困難的流程。而依賴于直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式的 Q Exactive UHMR質(zhì)譜儀，我們能夠獲得更寬的動態(tài)范圍和更高的分辨率，并且做到同時測量m/z 和 z，因此可以觀察到更多的蛋白質(zhì)形式。
 
 
依那西普/Etanercept是一種 Fc 融合蛋白（圖7，左圖），代表了一類新的治療性生物藥物。依那西普是一種腫瘤壞死因子（TNF）抑制劑，可阻斷導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫性疾病的炎癥和關(guān)節(jié)損傷的細胞因子瀑布級聯(lián)。表征復(fù)雜的生物治療藥物面臨著很多的分析挑戰(zhàn)，可能需要進行復(fù)雜的樣品處理和多個質(zhì)譜實驗。與傳統(tǒng)的集成質(zhì)譜方法相比，直接分析質(zhì)譜技術(shù)模式通過直接測定電荷狀態(tài)和質(zhì)量，使復(fù)雜的生物治療藥物的表征越來越可靠，從而使得質(zhì)量分布可視化的范圍更為廣泛，并且通過提高分辨率讓這個蛋白的更多類型被呈現(xiàn)。（圖7右圖）
  配備直接分析質(zhì)譜技術(shù)的Q Exactive UHMR質(zhì)譜儀在天然蛋白質(zhì)、糖蛋白、病毒顆粒的成分和結(jié)構(gòu)研究，抗原-抗體作用機理研究和疫苗研發(fā)方面有很大的未來市場空間：
 
 
★1）實現(xiàn)復(fù)雜樣品的精確分析，同時提供復(fù)雜樣品中各蛋白分子的m/z與z等信息。
★2）測定糖蛋白及其它翻譯后修飾造成的特定質(zhì)量分布圖，解釋蛋白與翻譯后修飾之間的關(guān)系，從而對糖蛋白相關(guān)的疾病診斷具有重要意義。
★3） 通研究DNA等生物大分子離子的電荷分布，以及質(zhì)量與電荷的關(guān)聯(lián)，推斷這些大分子的結(jié)構(gòu)，比如它的聚合程度等。
★4）在病毒研究中，可以用來確定病毒衣殼的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)及其組裝反應(yīng)的過程
★5）在基因療法研究和產(chǎn)品質(zhì)控中，可以用來測定腺病毒載體的空殼率，檢查載體內(nèi)的基因完整度。
★6）滅活疫苗、病毒載體疫苗以及核酸疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量控制、效果評價
   
★1）準(zhǔn)確的直接質(zhì)量測定，不需要根據(jù) m/z 去卷積
★2）相對于傳統(tǒng)的集成離子測量，分辨率最高可提高 20 倍
★3）僅需要較少的樣品或濃度較低的樣品
★4）可獲得高達 80,000 m/z 的測量值和兆道爾頓 (MDa) 的質(zhì)量測量值