天木生物助中國(guó)農(nóng)大、清華大學(xué)完成單細(xì)胞高通量培養(yǎng)

近日，天木生物DREM cell設(shè)備助力中國(guó)農(nóng)大、清華大學(xué)完成蜜蜂腸道微生物單細(xì)胞高通量培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)菌株級(jí)別功能多樣性研究。
 
各種不同的生態(tài)系統(tǒng)都存在微生物群落，典型的微生物群落包括土壤、海洋或江湖等環(huán)境微生物以及人體或動(dòng)物腸道微生物等。其中，腸道微生物群越來(lái)越引起人類的重視，越來(lái)越多的證據(jù)表明人體腸道微生物群的組成和活性變化與多種疾病和生態(tài)表型有關(guān)，如糖尿病、肥胖、結(jié)腸炎和嚴(yán)重抑郁癥等。因此，若研究腸道微生物與宿主的關(guān)系，則能夠更好地了解腸道共生體對(duì)疾病的作用機(jī)制，指導(dǎo)從腸道微生物角度出發(fā)的新的治療方法和策略的構(gòu)建，以達(dá)到治療或預(yù)防疾病的目的。
 
今年6月份，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的鄭浩團(tuán)隊(duì)和清華大學(xué)的張翀團(tuán)隊(duì)在 Microbiome 上發(fā)表了名為“Strain-level profiling with picodroplet microfluidic cultivation reveals host-specific adaption of honeybee gut symbionts”的研究論文，使用高通量皮升級(jí)液滴微流控細(xì)胞分選儀（DREM cell）開(kāi)發(fā)基于液滴的微流控技術(shù)培養(yǎng)蜜蜂腸道微生物，驗(yàn)證了微流控液滴平臺(tái)在腸道微生物培養(yǎng)組學(xué)中的可行性，為更復(fù)雜微生物群落的大規(guī)模研究鋪平了道路。
 
復(fù)雜微生物群由多種微生物組成，這些微生物是多物種復(fù)合體的一部分。盡管屬于同一屬和種的微生物擁有一個(gè)共同的、且對(duì)于細(xì)胞功能和物種的生存至關(guān)重要的核心基因組，但它們?nèi)匀粨碛邢喈?dāng)數(shù)量的菌株特異性基因，導(dǎo)致它們?cè)谏�理和毒性特性等方面的不同表型，這些差異菌株可能會(huì)在不同程度上改變腸道微生物群的功能，進(jìn)而影響到宿主健康。
 
因此鄭浩表示：僅在物種水平上研究微生物群落是不夠的，需要深入調(diào)查基因型和表型的多樣性。培養(yǎng)是微生物研究的基礎(chǔ)方法之一，但實(shí)際上由于培養(yǎng)條件的不適合，或是缺少互利共生的個(gè)體，很少有微生物可以在實(shí)驗(yàn)室條件下輕松培養(yǎng)，對(duì)于復(fù)雜群落而言，往往也只能成功實(shí)現(xiàn)其中一部分占多數(shù)的，或快速生長(zhǎng)菌株的有效表征，并且傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式通常是低通量的，豐富的菌株多樣性往往會(huì)在這個(gè)過(guò)程中被掩蓋。
 
幸運(yùn)的是，越來(lái)越強(qiáng)大的測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)了，該技術(shù)可更深入、更清楚地了解共生腸道微生物組的結(jié)構(gòu)、功能和多樣性。16S rRNA 基因測(cè)序（16S rRNA gene sequencing）和鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序（Shotgun metagenomic sequencing）是當(dāng)前用于微生物群落分析的兩種主要工具。
 
16S rRNA 基因測(cè)序一般用于通過(guò)選擇性擴(kuò)增和測(cè)序微生物 16S rRNA 基因的高變區(qū)來(lái)識(shí)別和分類微生物，可以通過(guò)相對(duì)少量的原始讀長(zhǎng)來(lái)獲得有代表性的細(xì)菌分類學(xué)估計(jì)。其具有高通量，成本低的特點(diǎn)，并擁有相當(dāng)多成熟的生物信息學(xué)工具。但這種方法的主要限制為分類群是根據(jù)基因組的單個(gè)區(qū)域的序列分配的，這導(dǎo)致了分辨率不足。此外，擴(kuò)增引物的選擇也影響很大，一些引物已被證明會(huì)導(dǎo)致特定分類群的代表性過(guò)高或過(guò)低，這可能導(dǎo)致對(duì)分類單元的表示存在潛在偏差。
 
鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序對(duì)從整個(gè)微生物群落中分離出來(lái)的所有微生物的基因組進(jìn)行測(cè)序。它的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)收集有關(guān)廣泛基因組區(qū)域的序列信息，能夠支持在物種水平上進(jìn)行更準(zhǔn)確的定義，提供更高的分類分辨率。同時(shí)還能支持進(jìn)一步進(jìn)行菌株水平的重建，得到新的基因或基因組，并對(duì)它們進(jìn)行功能注釋和途徑預(yù)測(cè)以產(chǎn)生微生物群落的詳細(xì)描述。但這種方法成本較高，需要深度測(cè)序獲得更高的覆蓋度以達(dá)到令人滿意的分辨率，以及更復(fù)雜的下游分析。

“雖然基于測(cè)序的方法不限于可培養(yǎng)的微生物群，但 16S rRNA 基因測(cè)序方法在種內(nèi)分析的分辨率上仍然極其有限，并且可能會(huì)被每個(gè)基因組的 16S rRNA 基因的多個(gè)不同拷貝混淆，這同樣會(huì)造成對(duì)實(shí)際存在于環(huán)境中菌株功能的誤判；鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序通過(guò)考慮更多標(biāo)記基因或全基因組來(lái)提供更多信息，目前也已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多工具來(lái)分析宏基因組數(shù)據(jù)來(lái)解決這些問(wèn)題，但來(lái)自取樣時(shí)間的或空間的偏差往往需要更深的測(cè)序深度來(lái)彌補(bǔ)，但這也帶來(lái)了急劇升高的成本。”鄭浩說(shuō)道。
因此，若有一種培養(yǎng)方法可突破傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的局限，則會(huì)大大減輕測(cè)序技術(shù)的壓力。基于液滴的微流控平臺(tái)或許是個(gè)不錯(cuò)的選擇。

液滴微流控
微流控（Microfluidics）是指一種在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操控的技術(shù)，在該技術(shù)下可以將化學(xué)、生物等實(shí)驗(yàn)室的基本功能微縮到一個(gè)幾平方厘米芯片上，因此又被稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”。作為微流控芯片研究中的重要分支，液滴微流控是一種在微尺度的通道內(nèi)利用流動(dòng)剪切力或表面張力的改變，將兩種互不相溶流體中的離散相流體分割成納升級(jí)及以下體積的微液滴，并驅(qū)動(dòng)微液滴運(yùn)動(dòng)對(duì)其進(jìn)行操控的技術(shù)。

張翀表示：基于液滴微流控的特征，我們可以通過(guò)在直徑為數(shù)十至數(shù)百微米并由不混溶的油和工程表面活性劑分割的介質(zhì)液滴種劃分微生物來(lái)消除群落培養(yǎng)中過(guò)度生長(zhǎng)的快速增長(zhǎng)種群的影響。由于微制造的物理孔或通道不會(huì)限制液滴，因此可以快速創(chuàng)建數(shù)百萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)單個(gè)腸道微生物體的高通量培養(yǎng)。這極大克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的缺陷，為通過(guò)培養(yǎng)來(lái)表征來(lái)自腸道共生體的稀有類群提供了機(jī)會(huì)。

為了證明微流控液滴平臺(tái)在腸道微生物群研究中的可行性，鄭浩和張翀團(tuán)隊(duì)將蜜蜂作為研究對(duì)象。原因是與其他動(dòng)物相比，蜜蜂的腸道細(xì)菌簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，宏基因組分析也表明，雖然蜜蜂腸道由數(shù)量有限的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育型組成，但仍然存在顯著的菌株水平多樣性，個(gè)別菌株具有獨(dú)特的基因組潛力和關(guān)鍵能力，這些能力在功能上與宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝和健康相關(guān)，為在菌株水平分析腸道共生體與宿主關(guān)系提供了很好的模型。

具體做法如下：首先，構(gòu)建了一個(gè)微流體液滴平臺(tái)，并產(chǎn)生了用蜜蜂腸道中的單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞包裹的液滴；隨后，收集液滴并進(jìn)行孵育培養(yǎng)，確定了液滴中微生物的生長(zhǎng)能力，宏基因組分析揭示了與常規(guī)測(cè)序方法相比蜜蜂腸道更高的菌株水平多樣性，證明了微流體平臺(tái)在分離和富集稀有微生物菌株方面的潛力。
最后，結(jié)合分箱策略，得到了蜜蜂腸道微生物的大量基因組草圖，并進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)和比較基因組分析。對(duì)雙歧桿菌屬的分析揭示了潛在分類單元的存在，它們?cè)诳缒み\(yùn)輸、肌醇利用以及多糖利用方面存在豐富的菌株多樣性。研究人員還得到了來(lái)自 Lactobacillus panisapium 的新菌株，該菌種在以往的研究中被認(rèn)為特異性來(lái)源于中華蜜蜂；通過(guò)進(jìn)一步的基因組比較，發(fā)現(xiàn)來(lái)自西方蜜蜂的菌株中獨(dú)特地含有一組與飲食阿拉伯糖利用相關(guān)的代謝基因簇，包括araf43A, rafB, abfA 和abfB，這可能與它對(duì)不同蜜蜂宿主的適應(yīng)密切相關(guān)。
 
“總體而言，結(jié)果證明了基于液滴的培養(yǎng)在研究蜜蜂腸道微生物多樣性方面的適應(yīng)性，同時(shí)這種方法也有潛力適用于其他復(fù)雜群落，在稀有類群的獲得以及功能鑒定方面發(fā)揮作用。”張翀說(shuō)道。

他補(bǔ)充道，對(duì)于腸道微生物，當(dāng)前的研究主要集中在特定培養(yǎng)基質(zhì)下的微流體液滴培養(yǎng)，結(jié)合 16s rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序以研究腸道微生物個(gè)體的膳食碳水化合物代謝或抗生素耐藥性。我們的研究則著重于通過(guò)隔離培養(yǎng)以富集在常規(guī)狀態(tài)下難以檢測(cè)的稀有類群，結(jié)合宏基因組的測(cè)序和分析，以較高通量實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道稀有微生物的發(fā)現(xiàn)，以及代謝途徑和功能預(yù)測(cè)，提供關(guān)于宿主和腸道共生體關(guān)系的嶄新理解。

“未來(lái)，我們可能會(huì)通過(guò)調(diào)整液滴大小、改善培養(yǎng)條件和測(cè)序方法來(lái)研究腸道真核微生物，并實(shí)現(xiàn)對(duì)單胞的高通量識(shí)別，這將進(jìn)一步擴(kuò)大我們對(duì)腸道復(fù)雜成員的理解。同時(shí)，我們的流程也可以進(jìn)一步應(yīng)用于人類腸道共生體的研究，擴(kuò)展對(duì)人類腸道稀有類群以及它們與健康關(guān)系的認(rèn)知和了解。” 研究團(tuán)隊(duì)所使用的液滴微流控細(xì)胞分選儀（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)的皮升級(jí)液滴微流控單細(xì)胞分選平臺(tái)，可將待篩選細(xì)胞進(jìn)行包被形成單細(xì)胞微液滴，結(jié)合熒光篩選模型，可以在細(xì)胞水平完成微生物的高通量分離、培養(yǎng)、檢測(cè)、分選等。
高通量皮升級(jí)液滴單細(xì)胞分選系統(tǒng)（DREM cell）相比于傳統(tǒng)篩選方法，篩選效率可提升1萬(wàn)倍，試劑消耗量可下降至百萬(wàn)分之一，在篩選通量顯著提升的同時(shí)，單克隆篩選成本大幅度降低。該儀器不僅可廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞等的高通量篩選，還可以應(yīng)用于蛋白、核酸、抗體等生物大分子篩選等相關(guān)研究領(lǐng)域。