正交試驗法在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化選擇中的應用

一．目的要求
對于一個生物作用過程，其結果或產(chǎn)物的得到受到多種因素的影響。如發(fā)酵中，菌種的生物活性、酶的濃度、底物濃度、溫度、pH 值、菌種生長環(huán)境中的氧氣、二氧化碳濃度、各種營養(yǎng)成分的比例等。對于這種多因素的實驗，如何合理地設計實驗，提高效率，以達到所預期的目的是需要進行認真考慮和周密準備的。
本實驗運用正交實驗法測定酵母用量、葡萄糖濃度、溫度、磷酸鹽用量這四個因素在不同水平對發(fā)酵過程和結果的影響，并應用生物統(tǒng)計學的計算方法分析處理實驗數(shù)據(jù)，求得什么樣的酵母用量、葡萄糖濃度、溫度、磷酸鹽用量對發(fā)酵效果最好，并確定影響實驗的關鍵因素及最適條件。
二．基本原理
正交實驗法是安排多因素、多水平的一種實驗方法，即借助正交表的表格來計劃安排實驗，并正確地分析結果，找到實驗的最佳條件，分清因素和水平的主次，這就能通過比較少的實驗次數(shù)達到好的實驗效果。實踐證明，正交法是一種行之有效的好方法，被廣泛地運用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學研究實驗。 ’
三．正交實驗法的基本步驟
1）．明確試驗目的，確定評價指標
評價指標有時只有一個，有時可能有多個。當評價指標多于兩個，為多指標試驗。
2）．挑選因素
影響試驗指標的因素很多，由于試驗條件的限制，不可能逐一或全面地加以研究，因此要根據(jù)已有的專業(yè)知識及有關文獻資料和實際情況，固定一些因素于最佳水平，排除一些次要的因素，而挑選一些主要因素。正交試驗設計法正是安排多因素試驗的有利工具。當因素較多時，除非事先根據(jù)專業(yè)知識或經(jīng)驗等，能肯定某因素作用很小而不選取外，對于凡是可能起作用或情況不明或看法不一的因素，都應當選入進行考察。
3）．確定各因素的水平
因素的水平分為定性與定量兩種，水平的確定包含兩個含義，即水平個數(shù)的確定和各個水平數(shù)量的確定。 對定性因素，要根據(jù)試驗具體內容，賦予該因素每個水平以具體含義。定量因素的量大多是連續(xù)變化的，這就要求試驗者根據(jù)相關知識或經(jīng)驗、或者文獻資料首先確定該因素的數(shù)量變化范圍，而后根據(jù)試驗的目的及性質，并結合正交表的選用來確定因素的水平數(shù)和各水平的取值。每個因素的水平數(shù)可以相等，也可以不等，重要因素或特別希望詳細了解的因素，其水平可多一些，其他因素的水平可以少一些。如果沒有特別重要的因素需要詳細考察的話，要盡可能使因素的水平數(shù)相等，以便減小試驗數(shù)據(jù)處理工作量。
4）．制定因素水平表
根據(jù)上面選取的因素及因素的水平的取值，制定一張反映試驗所要考察研究的因素及各因素的水平的“因素水平綜合表’’。該表在制定過程中，對于每個因素用哪個水平號碼，對應于哪個量可以隨機地任意確定。一般講最好是打亂次序安排，但一經(jīng)選定之后，試驗過程中就不能再變了。
5）．選擇合適的正交表
常用的正交表較多，有幾十個，可以靈活選擇。應注意的是，選擇正交表與選擇因素及其水平是相互影響的，必須綜合考慮，而不能將任何一個問題孤立出來。選擇正交表時一般需考慮以下兩個方面的情況：
①所考察因素及其水平的多少。選用的正交表，要能容納所研究的因素數(shù)和因素的水平數(shù)，在這一前提下，應選擇試驗次數(shù)最小的正交表。
②考慮各因素之間的交互作用。一般說來，兩因素的交互作用通常都有可能存在，而三因素的交互作用在通常情況下可以忽略不計。
6）．確定試驗方案
根據(jù)制定的因素水平表和選定的正交表來安排試驗時，一般原則如下：
①如果各因素之間無交互作用，按照因素水平表中固定下來的因素次序，順序地放到正交表的縱列上，每一列放一種因素。
②如果不能排除因素之間的交互作用，則應避免將因素的主效應安排在正交表的交互效應列內，以妨礙對因素主效應的判斷。
③把各因素的水平按照因素水平表中所確定的關系，對號入座后，試驗方案隨即確定。
7）．正交試驗結果的分析
正交試驗結果的直觀分析與正交試驗結果的方差分析相比，具有計算量小、計算簡單、分析速度快、一目了然等特點，但分析結果的精確性與嚴密性相對于方差分析來說稍差。直觀分析主要可以解決以下兩個問題：
①求最佳水平組合。該問題歸結為找到各因素分別取何水平時，所得到的試驗結果會最好。 極差的大小直接反映料各個因素對試驗指標影響的變化幅度，極差大表明該因素的影響越大，是主要因素；反之，極差小，表明該因素的作用不大，屬于次級因素。因此，可以通過比較各個因素的極差大小決定因素的主次順序。但因素影響的顯著性需通過方差分析確定。
四．實驗裝置
圖10－1 為5L 容積的發(fā)酵罐培養(yǎng)裝置示意圖。發(fā)酵罐為不銹鋼制的圓柱形，外有夾套以便加熱或冷卻。攪拌可采用電機帶動或磁力攪拌器�？諝膺^濾可采用介質層過濾或聚乙烯醇PVA 濾芯空氣過濾氣。采用可蒸汽殺菌的pH復合電極及pH控制裝置，溶解氧分析儀使用的是可反復蒸汽滅菌、原電極型覆膜電極。
采用2 臺泵，一臺用于流加酸堿，一臺用于流加消泡劑。所使用的輔料管應是可蒸汽滅菌，使用的管材有長期耐用的硅膠管(一般用)、氟化橡膠管(碳氫化合物用)和耐酸、堿用管等。
采用氧分析儀測定尾氣中的氧分壓，用紅外分析儀測定尾氣中二氧化碳分壓。

圖11－1 培養(yǎng)裝置示意圖
五．實驗方法
1) ．菌種：
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2）．培養(yǎng)基制備
培養(yǎng)基的加入量一般為罐容積的70％。將稱量好的培養(yǎng)基組分，經(jīng)溶解后加入到發(fā)酵罐中。此時培養(yǎng)液的體積為實際所需培養(yǎng)基容積的80％。
由于蒸汽殺菌過程中有大量的蒸汽轉變?yōu)樗�，使發(fā)酵液體積增大。對于合成培養(yǎng)基的滅菌操作，葡萄糖與磷酸鹽應分別滅菌后，在開始培養(yǎng)前加入以避免在殺菌過程中，葡萄糖與氮化合物之間發(fā)生美拉德(Malad)反應，以及磷鹽與其他金屬離子形成沉淀。溶液pH5．0.
除排氣口加棉塞，并包牛皮紙或鋁箔外，其他可用橡膠塞或截水夾封住。
3)．安裝控制裝置
連接好各種傳感器的管線及通風、水管等,安裝調試好pH 電極、溫度計、氧電極、消泡電極等。
4)．殺菌
夾套內通入加熱蒸汽，使培養(yǎng)液溫度達到80℃以上。隨后將蒸汽直接通人發(fā)酵罐，在121℃下殺菌15min。殺菌過程中，間斷打開各閥門，排出內部空氣，以保證各出管內殺菌完全。殺菌完成后，夾套內通入冷卻水，進行培養(yǎng)基的冷卻。為保證罐內正壓，應通入適量無菌空氣。
5)．接菌、培養(yǎng)
檢查溫度、通風和pH 等條件正常后接菌，將浸有酒精的脫脂棉圍繞在接種口周圍，點火后打開接種口，加入無菌水，調節(jié)好罐內培養(yǎng)液量,進而將種子培養(yǎng)液注入。接種量一般為1%～10％，蓋好接種口后，調節(jié)攪拌轉速至所需數(shù)值，培養(yǎng)開始。為了解培養(yǎng)過程中的變化，需定時取樣進行樣品分析。取樣后應通入加熱蒸汽，以防取樣管路污染雜菌。
6)．制定因素水平表和選定正交表進行正交試驗
7）．培養(yǎng)結束
將電極與培養(yǎng)液全部取出，培養(yǎng)液在121℃下殺菌15min 后，排放到指定地點。罐內應沖洗干凈。
8) 菌體量(X)分析方法
用去離子水適當稀釋培養(yǎng)液，在660nm 下測濁度。測干燥重量時，用事先干燥至恒重的定量濾紙(孔徑1．2pm)過濾培養(yǎng)液，用去離子水洗兩次，然后將其干燥至恒重(105℃，10h)，用電子天平稱重。
9) 數(shù)據(jù)處理
畫出培養(yǎng)液中葡萄糖(g／L)、酵母菌體量(g／L)隨培養(yǎng)時間的變化曲線。計算酵母產(chǎn)率(質量分數(shù)，葡萄糖)。

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