PCR引物設計技巧

 

自從1985年美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應（PCP） 以來，PCR已經(jīng)成為了分子生物學領域最基本也是最重要的技術(shù)手段之一 。然而能否找到一對合適的核苷酸片段作為引物，使其有效地擴增模板DNA序列，無疑決定著PCR的成敗�，F(xiàn)在動物遺傳育種早已進入了分子時代，在基因水平尋求影響動物遺傳表型的新基因突顯重要，因此引物設計無疑又成為了尋找新基因的重中之重。

 

引物的設計與初步篩選基本上通過一些分子生物學軟件和相關(guān)網(wǎng)站來完成的， 目前運用軟件Primer Premier 5 或美國 whitehead 生物醫(yī)學研究所基因組研究中心在因特網(wǎng)上提供的一款免費在線PCR引物設計程序 Primer 3來設計引物，再用軟件Oligo 6進行引物評估，就可以初步獲得一組比較滿意的引物。但是對于初學者來說，運用軟件和程序來設計引物好象無從著手，其實只要我們掌握了引物設計的基本原則和注意事項，所有問題便迎刃而解。因為無論是軟件還是程序，都是以這些基本原則和注意事項為默認標準來進行引物設計的。所以，我們在進行引物設計的時候大 可不必在軟件和程序的參數(shù)上花費過多的時間來思考，如果沒有特殊要求我們完全可以把一些參數(shù)設為默認值。下面我們主要討論一下引物設計的原則和注意事項。

①引物的長度一般為15-30 bp，最好在18~24 bp，因為太短易形成錯配(False priming) 降低特異性，而太長也會降低特異性，并且降低產(chǎn)量 。

②引物在模板內(nèi)最好具有單一性，也就是說在模板內(nèi)部沒有錯配。特別是3’端，一定要避免連續(xù)4個以上的堿基互補錯配。

③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差異不要太大，3’端最后5個堿基最好不要富含GC，特別是連續(xù)3個的G或C。

④DNA雙鏈形成所需的自由能AG，應該以5’端向 3’端遞減，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol 。

⑤避免形成穩(wěn)定的引物二聚體(Dimer and Cross DimeO 和發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)，AG高于4．5 keal／mol時易引發(fā) 上述兩種結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。

⑥ 引物所在的模板區(qū)域應該位于外顯子區(qū)，最好跨越一個內(nèi)含子區(qū)，這樣便于對擴增出來的片段進行功能鑒定和表型分析。

⑦ 如果以DNA為模板設計引物，產(chǎn)物長度在100—600 bp比較理想。而以mRNA為模板設計引物時，產(chǎn)物長度在150—300 bp比較理想。

⑧5’ 端對PCR影響不太大，可以引進修飾位點和標記物 。

 

只要掌握了以上原則和注意事項，我們可以在軟件和程序設計的一組引物中篩選出幾對我們需要的目標引物。Primer Premier 5和Oligo 6可以在/soft/下載，primer3的主頁位置在

 

http://www.genome.wi.mit.edu。

 

引物的二次篩選是指在初次篩選出的幾對引物中進一步篩選出適合我們進行特異、高效PCR擴增的那對引物。本步應注意以下兩點，一是得到的一系列引物分別在Genebank中進行回檢。也就是把每條引物在比對工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 的blast nr中進行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。一般連續(xù)10 bp以上的同源有可能形成比較穩(wěn)定的錯配，特別是引物的3’端應避免連續(xù)5-6 bp的同源。二是以mRNA為模板設計引物時要先利用生物信息學的知識大致判斷外顯子與內(nèi)含子的剪接位點(例如http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser軟件，然后棄掉正好位于剪接位點的引物。

 

當我們經(jīng)過初次篩選和二次篩選后得到的那對引物便可以用于合成，合成后我們經(jīng)過 PCR擴增可以對引物進行最終的評估。一是PCR擴增的特異性和效率。經(jīng)過PCR條件優(yōu)化后能否獲得特異性條帶，即無目的條帶之外的多余條帶。另外，PCR產(chǎn)物的量是否足夠，即無不出帶和條帶很弱的現(xiàn)象。二是以DNA為模板設計引物時，PCR擴增產(chǎn)物是否與預期PCR產(chǎn)物大小相當。如果相差太大G 于100 b ，有可能是錯配產(chǎn)物。三是是否形成引物二聚體帶。

我們結(jié)合引物最終評估和測序的結(jié)果可以對引物設計的成敗做出鑒定，為我們以后進行引物設計積累寶貴經(jīng)驗。

 

擴增已知基因時經(jīng)過初次篩選和二次篩選后得到的引物基本上能夠滿足要求，但是當運用比較基因組學分離新基因時，設計引物還應注意以下兩點：① 模板的選擇。如果以DNA為模板設計引物， 首先在Genebank中找到與待分離新基因同源的其它物種的該基因。利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的Blast工具和http://www.ebi.ac.uk/elustalw/的Clustalw工具把已檢索到的基因進行同源性比較，根據(jù)比較基因組定位的原理，選擇研究深入、標記稠密的人和哺乳動物(如小鼠)保守功能基因DNA序列設計引物[51，該引物區(qū)段要求在各物種間絕對保守，差異不要大于2 bp，特別是3’端必須完全同源。如果以電腦克隆策 略獲得的待分離物種新基因的EST一重疊群為模板設計引物，要求ESTs與信息探針之間同源性大于80％，長度大于100 bp，并且避免在EST的并接部位和可能的外顯子與內(nèi)含子剪接位點處設計引物。②引物序列最好位于相臨的外顯子區(qū)且至少距離外顯子與內(nèi)含子剪接處25 bD以上，這樣便于對擴增出來的片段進行功能鑒定和表型分析。