耦聯(lián)到抗體上的熒光團探針

熒光團探針的選擇依賴于下面的重要標準：

 

A.  儀器。比如，光源，濾片，檢測系統(tǒng)。

B.  多標記中對探針色彩區(qū)分程度的要求。例如，若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。

C.  要求的靈敏度。比如，Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。

 

耦聯(lián)的AMCA吸收光波長最大為350nm，發(fā)熒光則為450nm。對于熒光顯微鏡來說，AMCA可以用汞燈來激發(fā)，用紫外濾板來觀察。由于AMCA的信號相對較弱，單標實驗中不推薦使用AMCA。AMCA和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長波長熒光的熒光基團沒有或者只有極少的重疊，因此它最常用于多標記實驗中，比如免疫熒光顯微鏡和流式細胞儀。由于人眼不能很好的檢測藍色熒光，在多標記的實驗中，AMCA耦聯(lián)的二抗應(yīng)當被用于檢測大量的抗原。AMCA和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。如果使用在流式細胞儀中，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā)，因為它們發(fā)出的光線是在光譜的紫外區(qū)。

 

耦聯(lián)的熒光素基團吸收的最大波長為492nm，發(fā)射的最大波長為520nm。由于FITC被使用了很長時間而且產(chǎn)量很大，F(xiàn)ITC被廣泛應(yīng)用。熒光素的最大缺點是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。DTAF是熒光素的一個衍生物，激發(fā)和發(fā)射波長均和FITC相同。當和鏈霉親合素耦聯(lián)時，因為熒光強度上有明顯的區(qū)別，最好不使用FITC，而使用DTAF。

 

Cy2耦聯(lián)基團激發(fā)波長為492nm，發(fā)光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲存后會導(dǎo)致熒光微弱和擴散。

Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團激發(fā)光的最大波長為550nm，最強發(fā)射光為570nm。因為激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。

Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。

 Cy5耦聯(lián)基團的激發(fā)波長最大650nm，發(fā)光波長最大670nm。在氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的最大發(fā)射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應(yīng)當加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。

 

這些若丹明的衍生物耦聯(lián)基團具有不同的吸收波長 (550, 570, 596nm)和最大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）。盡管TRITC經(jīng)常和FITC一起在雙標記實驗中使用，使用RRX和TR可以得到更好的顏色區(qū)分。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記的實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆蓋都很少。氪氬燈激發(fā)光為488nm，598nm和647nm，分別是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激發(fā)波長。因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細胞儀中用FITC作雙標，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團要比若丹明好，。

親和層析純化的抗HRP及其耦聯(lián)物的抗體可以用來檢測HRP，或者放大含有HRP試劑的效果。哺乳動物細胞的免疫染色中，由于抗HRP的抗體不識別內(nèi)源性的過氧化物酶的類似酶，因此這個抗體的優(yōu)勢就是可以降低背景。