原代細(xì)胞培養(yǎng)之--培養(yǎng)技術(shù)

原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開(kāi)，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來(lái)的遺傳特性，也最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。
原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個(gè)體差異也照樣存在，原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。

1、組織塊培養(yǎng)法
組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)，方法簡(jiǎn)便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長(zhǎng)成肉眼可以觀察到的生長(zhǎng)暈，5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周?chē)�延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。其培養(yǎng)方法如下：
(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤(rùn)。
(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶?jī)A斜放置在37℃溫箱內(nèi)。
(3)培養(yǎng)2~4小時(shí)，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動(dòng)作要輕，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤(rùn)即可，培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開(kāi)始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長(zhǎng)，培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。 
原代細(xì)胞培養(yǎng)－2

2.消化培養(yǎng)法
該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。
某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。

3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法
對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

4.器官培養(yǎng)
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長(zhǎng)變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對(duì)器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。

1. 器官培養(yǎng)的特殊的要求
(1)需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng)，其營(yíng)養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來(lái)供給，因此，培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營(yíng)養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過(guò)1mm。
(2)器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：
① 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。
提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2，以維持pH。
2. 器官培養(yǎng)的方法
(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。
(2)將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。
(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過(guò)200μm，水平面積不超過(guò)10mm2，如為肝、腎不能大于1mm2。
(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達(dá)90%，培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。
(5)上述器官培養(yǎng)1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持

(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)

1、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))
凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來(lái)源的細(xì)胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應(yīng)在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細(xì)胞不是用于長(zhǎng)期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測(cè)定病毒之用，其細(xì)胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價(jià)提高和測(cè)定結(jié)果（如空斑）更加明顯、準(zhǔn)確，待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)的pH若有明顯變化，應(yīng)將原代細(xì)胞換液，即倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基，以便除去衰老、死亡的細(xì)胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細(xì)胞能獲得充足的營(yíng)養(yǎng)。
若用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時(shí)，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，為了利于該貼壁細(xì)胞充分貼壁和生長(zhǎng)，此時(shí)換液應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細(xì)胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次換液后，貼壁肌樣細(xì)胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)換液可將原懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶，然后分別補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對(duì)半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng)，原瓶的貼壁細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層，而新瓶中又會(huì)出現(xiàn)二次貼壁細(xì)胞，經(jīng)幾次換液也會(huì)逐漸長(zhǎng)成單層，在此類細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（濃度要在20%以上），以利細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

2、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)
凡來(lái)自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞。若作用于試驗(yàn)的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞濃度可在5～8×109/L范圍內(nèi)，然后進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長(zhǎng)因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長(zhǎng)，待細(xì)胞開(kāi)始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細(xì)胞不丟失），待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時(shí)，此時(shí)可考慮傳代。但千萬(wàn)不能急于傳代，一定要待細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行，以防傳代失敗。

(二)原代細(xì)胞的維持

1、貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的換液）
貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細(xì)胞生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞還未長(zhǎng)成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要。其換液方法比較簡(jiǎn)單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。若希望細(xì)胞能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時(shí)要換成含2%小牛血清的維持液。

2、懸浮細(xì)胞
凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無(wú)需換液，但加入生長(zhǎng)因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細(xì)胞不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細(xì)胞不適宜生長(zhǎng)，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，都需換液培養(yǎng)，待達(dá)到飽和密度時(shí)才能傳代。換液時(shí)，只能采用半量換液的方式，千萬(wàn)不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。半量換液的方法如下：
將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。