正常人臍靜脈原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)
PriCells - 正常人臍靜脈原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)
一、實驗試劑
1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：抗人Ⅷ因子抗體，熒光標記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
二、實驗器械
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5、10ml注射器
6、玻璃滴管
7、燒杯
8、15ml離心管
三、實驗流程
取材
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洗滌臍帶外血漬,將膠帶剪為15cm左右長
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PBS灌洗，去掉淤血
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推注空氣，排出殘存1 × PBS （pH 7.4 ）
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注射器灌注消化液（PriCells），至另一端有消化液流出時用止血鉗截斷，繼續(xù)灌注消化液至血管充盈用另一止血鉗截斷此端，放置到含抗生素1 × PBS （pH 7.4 ）燒杯中
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燒杯放置到37℃，15-20min水浴 恒溫消化，間隔2-3min搖動
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收集消化液，用培養(yǎng)基洗滌靜脈3-4次，3ml/次，之后加入消化終止液（PriCells）反應(yīng)
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離心，1000rmp,10min，棄去上清
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重懸，計數(shù)細胞
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接種密度以5 × 105個/ml
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培養(yǎng)37℃，5%CO2
四、實驗操作
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常分娩胎兒臍帶，長15-20cm。
3、材料預(yù)處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復(fù)洗滌，去除臍帶外部的血漬，之后用注射器吸取洗滌液反復(fù)灌住沖洗臍帶靜脈血管，至血管內(nèi)無血漬，洗滌液澄清為止。
4、消化液：用注射器關(guān)注空氣推注入血管中，排出殘余洗滌液，在從血管一端開口處注入消化液，當(dāng)另一開口端有消化液流出即可用止血鉗結(jié)扎血管，繼續(xù)灌注消化液，到血管充盈為止，同樣用止血鉗截流血管，放入含無菌PBS的燒杯中37℃水浴消化30min。
5、終止消化：去掉止血鉗，讓酶液流入預(yù)先準備好的培養(yǎng)皿中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)，用培養(yǎng)基灌注血管清洗3次。
6、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細胞。
7、培養(yǎng)細胞密度：調(diào)整細胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
8、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。
五、細胞鑒定
1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見細胞呈梭狀，細胞密度增高后呈現(xiàn)鵝卵石樣鑲嵌排列，有接觸抑制的特點。細胞具備良好的透光性。
2、免疫組織化學(xué)鑒定 ：利用Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測（或利用CD31和CD33免疫熒光染色鑒別內(nèi)皮細胞）。
3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細胞為3×104個/孔，48小時候細胞可以長滿，用鑷子取出
鋪滿細胞的蓋玻片備用。
4、細胞固定：用PBS洗滌細胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
7、標記性抗體：加入熒光標記抗體，37℃孵育30min。
洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
8、封片：封片劑封片。
9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，內(nèi)皮細胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強黃綠色熒光，細胞核周圍尤其明顯。
六、注意事項
1、選材注意選取圓潤飽滿無扭曲變形的臍帶，臍帶血管中無血塊凝固阻塞，臍帶長度大于15cm。取材過程盡可能保證無菌，若距離實驗室比較遠，可以將獲取的臍帶先用含有抗生素的PBS洗滌去除殘血，之后浸泡到此洗滌液中，低溫冰盒帶回實驗室。
2、注意盡可能消除血管內(nèi)的殘血，避免血細胞及某些血清成分對內(nèi)皮細胞貼壁的影響。
3、內(nèi)皮細胞分離損傷嚴重影響內(nèi)皮細胞的生長，因此應(yīng)嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間。
4、嚴格控制內(nèi)皮細胞培養(yǎng)條件。包括細胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。
5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實驗中，可以酌情考慮是否包被。
6、傳代培養(yǎng)細胞接種量為5×104個（25 cm2培養(yǎng)瓶），細胞倍增時間為48小時。細胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代， 傳代次數(shù)增加，細胞體積增大，細胞之間間隙增加，細胞貼壁牢固，傳代消化時間會有所延長。
七、PriCells細胞圖片
