原代肺泡上皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)

 

1、完全無血液殘留肺臟組織：

2、消化肺組織：

常用細(xì)胞消化酶：胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。

經(jīng)支氣管將酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。

3、分離純化細(xì)胞：

原代肺泡上皮細(xì)胞的分離純化主要方法：

（1）密度梯度離心法：

密度梯度離心分離細(xì)胞的原理是不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。 用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心法分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。

（2）濾膜分離法：

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞約10mm，比巨噬細(xì)胞(約25mm)和Ⅰ型細(xì)胞 (50mm-100mm)小，用150mm孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30mm-40mm孔徑的濾膜除去全部Ⅱ型細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞，采用 15mm的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡(jiǎn)單，它和其他分離方法聯(lián)合使用可以提高純度。

（3）流式細(xì)胞技術(shù)法：

根據(jù)不同細(xì)胞之間的熒光差異，用熒光物質(zhì)標(biāo)記篩選。肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，用親脂性熒光素標(biāo)記，可以得到純度很高的細(xì)胞。流式技術(shù)分離細(xì)胞的產(chǎn)量很低，但純度極高。這種技術(shù)經(jīng)過完善在將來會(huì)更有吸引力。

（4）免疫黏附法：

用IgG包被培養(yǎng)板，把肺泡上皮細(xì)胞懸液置于板上，巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非肺泡上皮細(xì)胞因?yàn)楹�有Fc片段的受體而與IgG結(jié)合，吸附到板上，不黏附的肺泡上皮細(xì)胞被沖洗下來，簡(jiǎn)便易行，可除去絕大多數(shù)的巨噬細(xì)胞，有效的提高肺泡上皮細(xì)胞純度。

（5）貼壁選擇法：

貼壁選擇原理：肺泡上皮細(xì)胞完成貼壁的時(shí)間不同，這種特性用肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)做篩選。

總之，根據(jù)肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)最終目的，綜合幾種方法能達(dá)到預(yù)期效果。

例如：（1）先用濾膜過濾；（2）再用IgG包被法。