正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)材料：

1. 嬰兒臍帶；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 培養(yǎng)用液：M199培養(yǎng)液（含20%小牛血清）；0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA（1:1，V：V）混合消化液；D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；

4. 培養(yǎng)器具：玻璃插管與輸液膠管，培養(yǎng)瓶或皿、白內(nèi)障、眼科剪、鑷子等；

培養(yǎng)方法：

1． 在無(wú)菌條件下，取健康產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶（長(zhǎng)20cm以上，不宜超過(guò)6h），選擇無(wú)夾痕、無(wú)扭曲、無(wú)凝血阻塞的部分；

2． 在臍靜脈兩端開(kāi)口處，分別用絲線扎緊并固定在50ml注射器和帶輸液膠管的玻璃插管上，注入D-Hanks液沖洗臍靜脈，至無(wú)血跡；

3． 用止血鉗夾住玻璃插管上的輸液膠管，從另一端的注射器向臍靜脈徐徐注入0.1%膠原酶溶液，至血管充盈。注意兩端封閉，以防液體返流。立即放入37℃的無(wú)菌D-Hanks液內(nèi)，15min后取出；

4． 通過(guò)注射器吸取收集酶液，同時(shí)注入含20%小牛血清的M199培養(yǎng)液沖洗靜脈，合并于同一離心管內(nèi)，以1000r/min離心7—10min；

5． 棄去離心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培養(yǎng)液（pH7.2），重新懸浮細(xì)胞。并調(diào)整至細(xì)胞密度為1.5×105—2.0×105個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

6． 第二天棄培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕洗1次，以去除不貼壁的細(xì)胞或死細(xì)胞。換入新鮮含20%小牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的M199培養(yǎng)液（pH7.2）。繼續(xù)置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

7． 每2—3d換培養(yǎng)液1次。換液時(shí)將原培養(yǎng)液棄掉1/2—2/3，然后加入新鮮的上述培養(yǎng)液至原來(lái)的量。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，即可行傳代培養(yǎng)；