用UPLC/MS/MS和UPLC/PDA 進行三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸分析

Mark E. Benvenuti 和 Aisling O’Connor
沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德

引言

北美地區(qū)最近出現(xiàn)的寵物食品污染事件突出了對寵物食品、動物飼料以及組織樣品中的三聚氰胺及其代謝物（三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸）進行快速、確定性分析的必要性。如 2007 年 5 月 7 日 的《華盛頓郵報》所述，在美國，未知數(shù)量的貓狗因食用了某些品牌的寵物食品而患病或死亡。這導致了數(shù)百萬磅寵物食品的召回。在食用了受污染寵物食品的動物腎臟內，發(fā)現(xiàn)三聚氰胺 - 三聚氰酸的結晶體迅速形成；這很可能是動物患病甚至死亡的原因。最近，公眾強烈要求制造商和政府監(jiān)管機構采用更準確、快速的分析方法進行食品安全性檢測；而此次疾病的突發(fā)使這一呼聲更加高漲。

在證實了此次污染的廣泛性之后，美國食品藥品管理局（ FDA ）報告稱美國的三聚氰胺存在于面筋和稻米蛋白濃縮物中；這些產品均從中國進口，作為寵物食品使用 1 。動物飼料中也受到了三聚氰胺的污染 2 ，這引起了關于受污染產品可能轉移至人類食品供應的擔憂。

本文介紹兩種方法：第一種方法是用于分析高濃度目標物質的沃特世 ® ACQUITY ® 超高效液相色譜（ UPLC ® ）光電二極管陣列法（ PDA ）；第二種方法是用于分析 ppb 級濃度的 ACQUITY UPLC ® /MS/MS 法。撰寫本文時，其中的一種目標物質“三聚氰酸一酰胺”在市面上買不到；因此，未用上述方法對其進行分析。目前認為該化合物與毒性效應無關，因此對分析過程不重要。兩種方法均可用不到兩分鐘的時間給出結果。

結果和討論

在含水混合液中，三聚氰胺和三聚氰酸可通過氫鍵形成晶格結構。這阻礙了對包含這兩種化合物的樣品進行同步萃取和分析。三聚氰胺不與三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺反應；因此可在一次檢測中，同時對這些化合物進行萃取和分析。結果表明：試驗部分所述的萃取步驟適用于三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。最近，美國食品藥品管理局公布了使用 SPE 萃取組織樣品中的三聚氰酸的詳細方法 3 。

試驗

萃取寵物食品中的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的預備程序

稱量 0.10 -1 g 寵物食品
在 5-10 mL 、 2% 的氫氧化銨溶液中進行萃取
用一個 0.45 微米的注射器式濾器進行過濾
將 100 μL 濾液與 900 μL 流動相混合后進樣

三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸由美國 TCI 公司提供。干狗糧從當?shù)氐囊患页�市中購得。三聚氰酸的標準儲備液通過加水溶解而制得。三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的標準儲備液通過溶解于 0.1% 的氫氧化鈉水溶液而制得。標準儲備液用溶于 90/10 乙腈／水的混合溶劑中 10 mM 醋酸銨進行進一步的稀釋，以配制出所需的濃度水平。

UPLC 的條件

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY UPLC
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC
2.1 x 100 mm 、 1.7 μm
柱溫： 35 ℃
流速： 700 μL/ 分鐘
流動相： 溶于 90/10 乙腈／水的 10 mM 醋酸銨
進樣量： 5 μL
ACQUITY PDA ： 200 -300 nm

質譜條件

質譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY TQD
軟件： 沃特世 MassLynx™ 第 4.1 版
電離模式： ESI 正離子（三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺）
ESI 負離子（三聚氰酸）
毛細管電壓： 3 kV
脫溶劑氣： 氮氣， 900 L ／小時
錐孔氣： 氮氣， 50 L ／小時
源溫度： 150 ˚C
脫溶劑氣溫度： 400 ˚C
采集： 多反應監(jiān)測（ MRM ）
碰撞氣： 氬氣， 3.5 x 10 -3 毫巴

對每種化合物采集兩種多反應監(jiān)測（ MRM ）的躍遷數(shù)據。主要躍遷用于定量分析，次要躍遷用于確認。 MRM 的躍遷、停頓時間、優(yōu)化后的碰撞能量以及錐孔電壓見表 1 。

表 1. 受監(jiān)測的 MS/MS 離子躍遷（ ESI 正離子），三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺；（ ESI 負離子）三聚氰酸

第 1 部分： UPLC /MS/MS 分析

ACQUITY UPLC-TQD 臺頂式串聯(lián)四極桿質譜儀可用不到 1.5 分鐘的時間完成對三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分離和確認。參見圖 3 。 ACQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱可給出清晰的峰形，從而可對寵物食品和面筋型樣品進行可信的定量分析。為實現(xiàn)準確定量，組織樣品的分析通常需要使用一種同位素標記型內標。本文未對組織樣品的分析進行說明，這是因為目前沒有適用于這些化合物的同位素標記型內標。

三聚氰酸在另一次檢測中進行分析，所用的色譜條件與三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的分析條件相同。圖 4 給出了氰尿酸的一幅 UPLC/MS/MS 色譜圖。

圖 5 給出了萃取得到的一種三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加標型干狗糧樣品。沃特世 TargetLynx™ 應用管理軟件可自動處理數(shù)據并報告定量分析結果；該軟件通過計算每種化合物的主要和次要 MRM 躍遷之間的離子比，可確定是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。圖 6 給出了關于三聚氰酸二酰胺的 TargetLynx 瀏覽器界面。

第 2 部分： UPLC/PDA 分析

圖 7 給出了使用 PDA 檢測型 ACQUITY UPLC 分離三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的加標型寵物食品的典型過程，該分離過程需時不到 1.5 分鐘。該分離使用相同的 ACQUITY BEH HILIC 2.1 x 100 mm 色譜柱，所用的流動相構成也與串聯(lián)四極桿質譜法相同。結果表明這兩種化合物的校準曲線在 1-25 ppm 的范圍內呈線性。

三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺的色譜峰可根據保留時間而輕松鑒定，并可通過積分進行定量分析。在圖 7 中， 1 分鐘處的未知峰在 221 nm 下出現(xiàn)λ最大值。檢測三聚氰酸二酰胺的純標準品時，觀察到一個具有相近保留時間和λ最大值的色譜峰；因此認定其為三聚氰酸二酰胺的一種雜質。緊鄰三聚氰酸二酰胺峰的第二個未知峰在 236 nm 下出現(xiàn)λ最大值，與未加標型狗糧的色譜峰相近。

除了保留時間的完全匹配之外，通過使用 PDA 和 Empower™ 軟件的 UV 光譜庫功能，也能提高成分鑒別的可信度。圖 8 和圖 9 分別給出了 10 ppm 三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺標準品以及 10 ppm 三聚氰酸標準品的光譜指數(shù)圖。圖 10 給出了一幅用以確認三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺加標型寵物食物樣品的光譜匹配情況的光譜指數(shù)圖

結論

ACQUITY UPLC - 臺頂式串聯(lián)四極桿質譜儀（ TQD ）可提供更高的靈敏度和質量特異度，從而可用不到 2 分鐘的時間定量檢出 ppb 水平的三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺。使用次要的 MRM 離子躍遷可對加標型狗糧中是否存在三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺進行確認。由于存在形成三聚氰胺 - 三聚氰酸結晶體的風險，因此三聚氰酸在另一次色譜檢測中進行分析。

當不需要較高的靈敏度和質量特異度時， ACQUITY UPLC PDA 檢測可作為 UPLC/MS/MS 的一種快速而劃算的替代方法�？焖俜治鋈�聚氰胺及其代謝物的能力可簡化與質控或產品合規(guī)相關的工作流程。

參考文獻

1. 《華盛頓郵報》的網址： http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/ 2007/05/06 /AR2007050601034.html

2. FDA 的網址： http://www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/petfood.html

3. 在線文章： http:/// ，“用 LC-MS/MS 測定組織中的三聚氰胺和三聚氰酸的簡化方法”，由 FDA 方法開發(fā)分部的 Alexander J. Krynitsky 撰寫