人骨髓不連續(xù)密度梯度離心用于間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)

試劑和材料：
1. 完全培養(yǎng)基：α-MEM：α-低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無(wú)核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存于4℃，不超過(guò)2周；
2. 無(wú)鈣或鎂的磷酸鹽緩沖液；
3. 無(wú)鈣或鎂的Hank′s平衡鹽溶液；
4. Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液；
5. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
6. 塑料組織培養(yǎng)皿，直徑15cm；
7. 塑料微量移液器槍頭，10μl；
8. 0.85%臺(tái)盼藍(lán)鹽溶液；
9. 微量離心管；
10. 帶吊桶式轉(zhuǎn)頭的低溫臺(tái)式離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 去除抗凝管蓋子，將骨髓液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。加入室溫的HBSS，確保體積達(dá)到25ml；
2. 取另一個(gè)50ml離心管，加入20ml Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液，將25ml細(xì)胞懸液輕輕加到Ficoll上層。HBSS與Ficoll間的界面不能被破壞；
3. 關(guān)閉閘，室溫1800g離心30min；
4. 離心完畢，于Ficoll和HBSS的界面收集白色細(xì)胞層，將其移至新的50ml離心管中；
5. 用HBSS將收集到的細(xì)胞懸液體積調(diào)整至3倍，室溫1000g離心10min。重復(fù)洗滌；
6. 用30ml預(yù)熱至37℃的CMM重懸細(xì)胞；
7. 取10μl細(xì)胞懸液加到10μl臺(tái)盼藍(lán)中，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器評(píng)價(jià)細(xì)胞的存活率，存活率需高于80%；
8. 將30ml細(xì)胞懸液移至直徑15cm組織培養(yǎng)皿中，于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少15h；
9. 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)基；
10. 加入20ml預(yù)熱的PBSA，潤(rùn)洗單層細(xì)胞，棄去；
11. 重復(fù)潤(rùn)洗過(guò)程3次；
12. 加入30ml預(yù)熱的新鮮CMM；
13. 每隔一天重復(fù)此潤(rùn)洗和更新培養(yǎng)基操作，共6天；
14. 6天后，在倒置顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，貼壁的、成纖維細(xì)胞樣MSCs克隆在培養(yǎng)皿中清晰可見(jiàn)。有時(shí)可能有造血細(xì)胞污染的跡象，但這些細(xì)胞可以在傳代時(shí)被去除。培養(yǎng)物達(dá)到50%—60%匯合時(shí)，可以進(jìn)行MSCs培養(yǎng)物的擴(kuò)增和凍存；