數(shù)字PCR，LunaProbesTM和MAAB相結(jié)合可以檢測(cè)到低于0.01%的等位基因的突變

數(shù)字PCR，LunaProbes^TM和MAAB相結(jié)合可以檢測(cè)到低于0.01%的等位基因的突變
Matt Poulson, Jason McKinney
Idaho Technology, Inc. Salt Lake City, Utah, USA

引言

    低水平突變的檢測(cè)促使了許多新方法的發(fā)展。我們結(jié)合現(xiàn)有的三個(gè)技術(shù)：數(shù)字PCR，非標(biāo)記探針?lè)ê蚆AAB（突變等位基因的偏向性擴(kuò)增）（見(jiàn)圖1）。數(shù)字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要許多重復(fù)的樣本使模板稀釋至約1拷貝/反應(yīng)。將原始的數(shù)字PCR進(jìn)行一些改進(jìn)后可以進(jìn)行高分辨溶解曲線(xiàn)分析（HRM），要求模板稀釋為5個(gè)拷貝/反應(yīng) (McKinney, 2007)。這表明，如果存在突變的等位基因，一個(gè)反應(yīng)中至少包括20%的等位基因并且可以檢測(cè)到異源雙鏈的存在。通常數(shù)字PCR檢測(cè)的靈敏度約為2%。并且靈敏度是可以增加的，這主要取決于重復(fù)檢測(cè)的數(shù)量。非標(biāo)記探針?lè)ㄔ赑CR反應(yīng)中加入3’端封閉的非標(biāo)記寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM儀器時(shí)除了進(jìn)行掃描之外，非標(biāo)記探針增加了基因分型的功能（見(jiàn)圖2）。非標(biāo)記探針的靈敏度大約在5%（Wall，2007）。MAAB利用非標(biāo)記探針增加了穩(wěn)定性，探針與野生型等位基因完全匹配，和突變的等位基因不完全匹配，使突變的等位基因得到優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增。MAAB的靈敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本實(shí)驗(yàn)中，我們結(jié)合這三種方法來(lái)增加HRM的靈敏性和有效性。

材料和方法

    苯丙氨酸羥化酶基因11外顯子（PAH×11）存在一個(gè)SNP，使用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)。兩個(gè)等位基因純合子樣品進(jìn)行了鑒定。野生型和純合突變樣本的標(biāo)準(zhǔn)化濃度為15ng，然后混合進(jìn)行一系列稀釋?zhuān)�突變的等位基因可以�?.01%。1%、0.1%和0.01%的等位基因樣本然后連續(xù)稀釋到5-100拷貝。之后，1%、0.1%和0.01%突變的等位基因使用96孔板分別采用數(shù)字PCR，數(shù)字PCR+非標(biāo)記探針以及數(shù)字PCR+非標(biāo)記探針+MAAB的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)重復(fù)，100%野生型和100%突變樣品每個(gè)反應(yīng)15ng以及兩個(gè)不加模板的對(duì)照。MAAB和數(shù)字PCR+非標(biāo)記探針+MAAB的方法使用Eppendorf Realplex4 Master Cycler Pro S (Eppendorf, Westbury, New York)，退火溫度為57℃，可以達(dá)到MAAB的條件。Eppendorf儀器的溫度轉(zhuǎn)換率可以達(dá)到6℃/s�？焖俚纳郎厮俾蕦�(duì)于完成MAAB實(shí)驗(yàn)的PCR是至關(guān)重要的。在PCR退火時(shí)快速的升溫速率探針和目的區(qū)域緊密結(jié)合從而有效的阻礙了野生型等位基因引物的延伸�？焖俚纳郎厮俾室部梢詼p少野生型等位基因的擴(kuò)增，探針和野生型等位基因鏈解鏈之后，在變性過(guò)程中減少了擴(kuò)增WT等位基因的酶的時(shí)間。數(shù)字PCR和數(shù)字PCR+非標(biāo)記探針在Bio-Rad IQ thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA)上運(yùn)行。退火溫度為68℃，在72℃延伸，以去除任何等位基因的偏差。樣品擴(kuò)增完用LightScanner96進(jìn)行溶解分析（Idaho Technology Inc., Salt Lake City)（見(jiàn)圖2）。

結(jié)果和討論

    數(shù)字PCR每個(gè)反應(yīng)使用的模板量為5ng（大約1.5copies）。數(shù)字PCR僅能對(duì)擴(kuò)增峰進(jìn)行分析。數(shù)字PCR在這一稀釋濃度時(shí)可以成功擴(kuò)增，并且可以檢測(cè)到雜合樣本中0.1%的突變。在其他等位基因的實(shí)驗(yàn)中，數(shù)字PCR不能夠檢測(cè)出樣品中任何的突變的等位基因。加上非標(biāo)記探針?lè)ㄖ�后不僅可以提高數(shù)字PCR的靈敏度，而且可以檢測(cè)到每一個(gè)突變等位基因混合后的突變。數(shù)字PCR加非標(biāo)記探針和MAAB的方法使突變的等位基因的檢測(cè)能力增加了，42個(gè)樣本檢測(cè)到1%的突變混合，37個(gè)樣本檢測(cè)到0.1%，43個(gè)樣本檢測(cè)到0.01%（見(jiàn)圖3）。盡管使用非標(biāo)記探針和MAAB的數(shù)字PCR是技術(shù)上非數(shù)字化的模板拷貝數(shù)，但是仍要小于常規(guī)PCR的模板量。MAAB在高WT等位基因的背景下能夠增加檢測(cè)突變等位基因的能力。加上非標(biāo)記探針的數(shù)字PCR和MAAB技術(shù)使用的模板濃度達(dá)到300pg（100copies/reaction）時(shí)突變的檢測(cè)率仍舊能夠達(dá)到0.01%（見(jiàn)圖4）。

結(jié)論

    檢測(cè)低水平的DNA突變有許多用途。其中包括檢測(cè)致病菌耐藥性、非侵入性產(chǎn)前篩查，低水平體細(xì)胞突變以及檢測(cè)外周血治療后的一些其他疾病。結(jié)合使用數(shù)字PCR，非標(biāo)記探針和MAAB后靈敏度可以增加10-100倍，而且可以通過(guò)具體的探針?lè)鍋?lái)確定突變的等位基因，可以減少測(cè)序的費(fèi)用。