WAVETM 生物反應(yīng)器中的 Cytodex™ 微載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝

 

    WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)多用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。然而，用于細(xì)胞治療和疫苗生產(chǎn)的多種細(xì)胞為貼壁依賴(lài)型的，需要一個(gè)可貼附的生長(zhǎng)表面。在本研究中，Cytodex 微載體被應(yīng)用在 CellbagTM 生物反應(yīng)器中以擴(kuò)增 Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)和 Vero細(xì)胞。為了優(yōu)化細(xì)胞貼附，測(cè)試了兩種細(xì)胞株的不同搖動(dòng)混合條件。我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分對(duì)細(xì)胞貼附有顯著的影響；例如在低血清培養(yǎng)基中的 MDCK 和 Vero細(xì)胞，用間歇式和連續(xù)搖動(dòng)混合都可以使細(xì)胞貼附到微載體上。然而，在無(wú)血清條件下，Vero細(xì)胞在間歇式搖動(dòng)混合下可以獲得高貼壁率。生長(zhǎng)在 WAVE  Bioreactor系統(tǒng)中的MDCK細(xì)胞可以被放大到2 L和10 L工作體積。 細(xì)胞達(dá)到最大密度為3×106細(xì)胞/ml。Vero 細(xì)胞在 2  L 工作體積下的Cytodex 1和Cytodex 3微載體上培養(yǎng)，無(wú)血清條件下達(dá)到 1.4×106細(xì)胞/ml 最大密度。用轉(zhuǎn)瓶同樣條件可以獲得相同密度的Vero細(xì)胞，WAVE中細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。

 

    數(shù)據(jù)顯示 WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)是成功用于 MDCK 和 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)的通用平臺(tái)，可以方便的進(jìn)行規(guī)模放大，是對(duì)傳統(tǒng)攪拌罐生物反應(yīng)器或轉(zhuǎn)瓶的一種快速和方便的替代系統(tǒng)。

 

    介紹

    與滾瓶  (Roller Bottle)中的細(xì)胞培養(yǎng)不同，貼壁細(xì)胞在微載體上的培養(yǎng)使它相對(duì)容易進(jìn)行生產(chǎn)工藝的規(guī)模放大。此外，微載體使細(xì)胞能夠在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增，與多個(gè)小T型瓶等塑料培養(yǎng)容器相比，生物反應(yīng)器可以提供更好的工藝參數(shù)自動(dòng)控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度的同時(shí)減少污染的危險(xiǎn)。一次性生物反應(yīng)器的使用減少了投資成本、提高靈活性（簡(jiǎn)化批次間的輪換準(zhǔn)備等操作） ，消除了生產(chǎn)容器清洗驗(yàn)證的需要。

 

    WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)是設(shè)計(jì)用于人、動(dòng)物、植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的一次性發(fā)酵設(shè)備， 并可以用于細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)。 WAVE Bioreactor系統(tǒng)不需要清洗或滅菌， 這減少了生物制藥生產(chǎn)中工藝驗(yàn)證的需要。盡管WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)多用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，本文的研究表明WAVE反應(yīng)器也適合微載體上貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。

 

    本文描述了 MDCK 和 Vero 細(xì)胞在 WAVE Bioreactor 系統(tǒng)中 Cytodex 微載體上的培養(yǎng)。我們對(duì)微載體培養(yǎng)所必需的參數(shù)如最佳搖動(dòng)混合條件和工作體積范圍、細(xì)胞貼附效率、最大細(xì)胞密度以及從 2  L工作體積放大到10 L的可行性進(jìn)行了深入研究。使用細(xì)胞特異性的參數(shù)如貼附、生長(zhǎng)速率和最大細(xì)胞密度等，對(duì) WAVE  Bioreactor系統(tǒng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)進(jìn)行了比較和評(píng)價(jià)。WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)中貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的一般操作程序如圖1所示。

 

    細(xì)胞株，培養(yǎng)基和儲(chǔ)存液  MDCK細(xì)胞來(lái)自ECACC (Nr. 84121903)。細(xì)胞培養(yǎng)在含有 2%  FBS  (CH30160.03, HyClone)的 UltraMDCK  (12-749Q,  Lonza)培養(yǎng)基中。細(xì)胞在T型瓶和細(xì)胞工廠中的常規(guī)培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)中的接種過(guò)程中，MDCK 細(xì) 胞 先 用 PBS-EDTA  (E8008, Sigma  Aldrich)洗滌，然后用 accutase 酶(L11007, PAA Laboratories)進(jìn)行消化。

 

    Vero細(xì)胞來(lái)自ATCC (Nr. CCL 81)。使用DMEM/Ham’s 為基礎(chǔ)的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。使用含0.2% Pluronic F68 (Sigma Aldrich)的培養(yǎng)基在WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞括增。在T型瓶和細(xì)胞工廠的常規(guī)培養(yǎng)中使用胰蛋白酶（Gibco BRL）消化細(xì)胞。源于大豆(1 mg/ml in PBS)的胰蛋白酶抑制劑STI (Sigma Aldrich)和EDTA用于胰蛋白酶消化的終止。Vero細(xì)胞在接種到微載體之前用0.02% EDTA 消化。然后補(bǔ)加培養(yǎng)基。

 

    培養(yǎng)容器  在常規(guī)培養(yǎng)中，MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)在T 型瓶和多層細(xì)胞工廠（Corning Life Sciences，Sigma Aldrich）中用于接種準(zhǔn)備。

    在常規(guī)培養(yǎng)中Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)在T型瓶和多層細(xì)胞工廠中，用于接種準(zhǔn)備。在125 ml Techne轉(zhuǎn)瓶(Spinner Flask,  Bibby-Scientific Ltd)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，工作體積為60 ml。Spinner Flask轉(zhuǎn)瓶以50 rpm攪拌混合。

 

    微載體  Cytodex  3微載體被用于MDCK細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，Cytodex  1 和 Cytodex  3 被用于Vero細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)。微載體在硅化國(guó)的玻璃容器中進(jìn)行水化和高壓滅菌。在用不含Ca2+和Mg2+離子的PBS中洗滌3次后，微載體在121℃高壓滅菌15 min，并在 4℃下無(wú)菌保存。微載體先用培養(yǎng)基洗滌并在接種前24  h轉(zhuǎn)移到Cellbag中進(jìn)行平衡。所使用的Cytodex 1和Cytodex 3 的量為3 g/l。為了防止微載體吸附到玻璃表面，轉(zhuǎn)移瓶和轉(zhuǎn)瓶都經(jīng)過(guò) Sigma  Cote  (Sigma Aldrich)硅化處理。

 

    用于MDCK和 Vero細(xì)胞的生物反應(yīng)器  WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)由一個(gè)帶有一次性塑料細(xì)胞培養(yǎng)袋的搖動(dòng)平臺(tái)組成，配備CO₂ 氣體混合器 (CO2MIX20) 或WAVEPOD™控制塔用于控制pH、溫度、氧氣和混合。MDCK細(xì)胞在Cellbag-10 L和Cellbag-50  L的WAVE  Bioreactor System 20/50中培養(yǎng)。Vero細(xì)胞在Cellbag-2 L和Cellbag-10 L的WAVE Bioreactor  System 20/50中培養(yǎng) 。WAVEPOD 控制塔用于pH、溫度、氧氣和混合等參數(shù)的監(jiān)測(cè)和反饋控制。

 

    染色溶液  使用溶解于0.1 M檸檬酸中的0.1%結(jié)晶紫細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行 MDCK和 Vero 細(xì)胞的細(xì)胞核計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)（0.1%溶解在PBS中）用于測(cè)定細(xì)胞活率。 對(duì)于Vero細(xì)胞， 用于細(xì)胞固定和微載體培養(yǎng)物顯微鏡觀察的 Hematoxylin 蘇木紫染料溶液  (Carl Roth GmbH)由 0.9 g蘇木紫、0.18 g NaIO₃、15.45 g Al K(SO4)₂ ×12 H₂0、45 g 水合Chloralhydrate (Carl Roth GmbH) 和1 g  一水檸檬酸溶解于1 L的蒸餾水中配制而成。

 

    細(xì)胞培養(yǎng)-MDCK細(xì)胞  MDCK細(xì)胞按照1:5到1:6每周傳代兩次。對(duì)于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和微載體接種，MDCK細(xì)胞先用 PBS-EDTA 洗滌，然后通過(guò)與Accutase酶在37℃孵育30 min使細(xì)胞從微載體上脫落。我們?nèi)〕鲆徊糠置撀涞腗DCK 細(xì)胞樣品并用 CEDEX  (Innovatis)測(cè)定細(xì)胞活率，此結(jié)果被用于計(jì)算達(dá)到目標(biāo)接種密度所需的細(xì)胞數(shù)量。使用轉(zhuǎn)移瓶將懸浮細(xì)胞加入到Cellbag中。

 

    細(xì)胞培養(yǎng)-Vero細(xì)胞  Vero 細(xì)胞按照 1:3 到 1:4 每周傳代兩次。在這種條件下，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化的微載體接種難度較大，因?yàn)橐让溉菀紫魅跫?xì)胞貼附從而影響細(xì)胞在微載體上的鋪展。因此， 細(xì)胞用含有0.02 % EDTA的無(wú)Ca ²⁺ 和Mg ²⁺的PBS 從細(xì)胞工廠表面消化。10 層細(xì)胞工廠用 PBS 洗滌，細(xì)胞用100 ml EDTA 溶液消化后在37℃孵育 20 min。孵育后，我們加入500 ml的細(xì)胞培養(yǎng)基并合并所有細(xì)胞層的接種物。我們抽取一部分細(xì)胞樣品用細(xì)胞血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。使用臺(tái)盼藍(lán)染色（0.1%臺(tái)盼藍(lán)溶于PBS）測(cè)定細(xì)胞活率。下一步，我們測(cè)定達(dá)到特定接種密度所需要的懸浮細(xì)胞量，然后轉(zhuǎn)移瓶中的細(xì)胞通過(guò)無(wú)菌焊接加入到Cellbag中。

 

    取樣  每天對(duì)細(xì)胞取樣以確定密度和形態(tài)。在取樣前，適當(dāng)提高反應(yīng)器的攪拌速率以保證微載體均勻懸浮 （對(duì)Cellbag-2 L為16 rpm和12^°，對(duì)Cellbag-10 L為18 rpm和5°）。在提高攪拌速率2 min后，從取樣口取出4 ml載體懸液，同時(shí)反應(yīng)器保持連續(xù)搖動(dòng)。然后反應(yīng)器的攪拌參數(shù)被恢復(fù)到細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的工作參數(shù)，將樣品轉(zhuǎn)移到離心管中。先沉降微載體，丟棄上清，將含有 Vero細(xì)胞的微載體重懸在1 ml 含有0.1%結(jié)晶紫的0.1 M檸檬酸溶液中，然后孵育1.5 h。釋放出的細(xì)胞核用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。對(duì)于MDCK 細(xì)胞，載體重懸在含有0.1%結(jié)晶紫的檸檬酸和Triton  X-100溶液中。然后載體懸液被漩渦振蕩30 s，使用 Bürker chamber計(jì)數(shù)細(xì)胞核。

 

    0.5 ml Vero細(xì)胞微載體懸液被轉(zhuǎn)移到小離心管中。在微載體沉降后，丟棄上清，貼在微載體上的Vero細(xì)胞使用0.3 ml蘇木紫溶液固定并染色。微載體在顯微鏡下放大100倍進(jìn)行觀察，用于顯微拍照。

 

    微載體培養(yǎng)的最佳工作體積  確定Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L的最佳工作體積。培養(yǎng)袋中的推薦工作培養(yǎng)體積為最大推薦體積的40 %（即Cellbag-10 L為2 L，Cellbag-50 L為10 L）。微載體密度為3 g/l Cytodex 3，接種密度為0.3×10⁶細(xì)胞/ml。對(duì)每種Cellbag和培養(yǎng)體積，分別測(cè)試以下?lián)u動(dòng)條件：10 rpm和5^º、12 rpm和5º、14 rpm和5º和12 rpm and 6^º。 

 

    微載體培養(yǎng)的最佳混合條件  對(duì)于工作體積為2 L的 Cellbag-10 L進(jìn)行最佳混合的研究。在Cellbag-10  L中培養(yǎng)基和微載體在 37℃和 5%二氧化碳通氣下平衡 2  h。按照 0.3×106細(xì)胞/ml 的初始密度接種， 并在細(xì)胞-微載體貼附階段使用連續(xù)的搖動(dòng)方式。細(xì)胞生長(zhǎng) 18  h 達(dá)到大約0.6×106細(xì)胞/ml 的細(xì)胞密度后，以階梯方式逐漸提高搖動(dòng)速度。在 5º、6º 和7º 下分別對(duì)初始搖速12 rpm進(jìn)行測(cè)試。 搖速按照階梯方式每小時(shí)逐漸提高，直到細(xì)胞開(kāi)始從微載體上脫落。

 

    微載體培養(yǎng)的最佳工作體積和混合速度的確定當(dāng)我們使用 20%到 80%的Cellbag最大工作體積時(shí)，微載體培養(yǎng)可以產(chǎn)生均勻的微載體混合分布（圖 2）。

 

    在工作體積小于 20%的 Cellbag 最大工作體積時(shí)，部分微載體有可能粘在 Cellbag上，而超過(guò)80%工作體積可能會(huì)產(chǎn)生不均勻的微載體混合。

 

圖 3顯示搖動(dòng)角度為5º、6º和7º時(shí)所獲得的微載體均勻混合。超過(guò)8 rpm的搖動(dòng)速度產(chǎn)生均勻的微載體混合效果。在搖動(dòng)速度為16 到 20  rpm時(shí)MDCK細(xì)胞從微載體上脫落。

 

 

    研究的目的是為了找到在WAVE Bioreactor System 20/50（細(xì)胞培養(yǎng)體積達(dá)到 25L）中MDCK細(xì)胞貼附到Cytodex  3微載體的最佳條件，在培養(yǎng)前4  h 的貼壁階段，我們比較了3種不同的混合方式：

 

1） 間歇混合：每 30 min 以 12 rpm 和 6º間歇混合2 min（圖4），其他時(shí)間停止搖動(dòng)；4 h 后采用連續(xù)搖動(dòng)(10 rpm和 5º)

 

2） 半間歇混合：每30分鐘以12 rpm 和6º加速混合2 min，其他時(shí)間保持6 rpm 和3.3º的低速連續(xù)搖動(dòng)。4 h后采用連續(xù)搖動(dòng)(10 rpm和5º)

 

3） 連續(xù)搖動(dòng)混合：搖動(dòng)速度8 rpm和5º。4 h后采用連續(xù)搖動(dòng)(10 rpm和5º)

 

    微載體用量為3 g/l的 Cytodex3，接種細(xì)胞密度為0.3×106細(xì)胞/ml。培養(yǎng)條件為37℃，pH 7.3，5% CO2，采用光纖溶氧電極監(jiān)測(cè)溶氧水平。培養(yǎng)基含有 2%  FBS。每小時(shí)取樣并用結(jié)晶紫染色測(cè)定總細(xì)胞密度，上清中的懸浮細(xì)胞和死細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色。MDCK細(xì)胞在接種后1 h開(kāi)始貼附到微載體表面（圖 7A）。培養(yǎng)3 h后，85%的接種細(xì)胞貼附（圖7B）。18 h后，細(xì)胞在微載體表面鋪展并開(kāi)始生長(zhǎng)（圖7C）。

 

    盡管連續(xù)混合能夠使細(xì)胞在微載體上產(chǎn)生更均一的分布，但間歇式、半間歇和連續(xù)搖動(dòng)混合步驟之間沒(méi)有觀察到細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)的任何顯著性差別（圖8、9 和10）。在 2% FBS的低血清條件下，不同的混合步驟表現(xiàn)出類(lèi)似的結(jié)果， 且MDCK細(xì)胞的貼壁條件具有很好的耐用性。

 

    Vero細(xì)胞貼附微載體

 

    我們使用不同的搖動(dòng)方案和培養(yǎng)基組成研究Vero細(xì)胞對(duì)Cytodex 3 微載體的貼附。在Cellbag-2L中以600 ml的工作體積進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。連續(xù)搖動(dòng)參數(shù)被設(shè)置為12 rpm和5.5º；以16 rpm和5º間歇搖動(dòng)2 min；然后設(shè)置為0 rpm和0º停止搖動(dòng)18 min。在6 h 后，上述所有的搖動(dòng)方式都轉(zhuǎn)為12 rpm和18º的連續(xù)搖動(dòng)模式。圖11顯示在含血清條件下，連續(xù)或間歇搖動(dòng)混合期間可獲得大約90%的細(xì)胞貼附。在無(wú)血清條件下，間歇式混合方式獲得80%貼附，而連續(xù)混合獲得30%貼附。

 

    MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)和放大（2% FBS）

 

    為了研究在 Cellbag 生物反應(yīng)器中 MDCK細(xì)胞擴(kuò)增的可放大性，在兩種不同大小的袋子之間比較最大細(xì)胞密度和細(xì)胞生長(zhǎng)速率 Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L。 袋子的工作培養(yǎng)體積采用最大工作體積的40%（即Cellbag-10 L中為2 L，  Cellbag-50 L中為10 L）。

 

    微載體用量為3 g/l的 Cytodex3， 接種細(xì)胞密度為0.3×106細(xì)胞/ml。MDCK細(xì)胞采用搖動(dòng)速度8 rpm和 5º角度混合。細(xì)胞培養(yǎng)期間，在保持角度不變的條件下將搖動(dòng)速度以階梯方式逐漸從 8  rpm 提高到 14 rpm。培養(yǎng)溫度 37℃，pH  7.4，并監(jiān)測(cè)溶氧水平，細(xì)胞培養(yǎng)基中含有2% FBS。

 

    經(jīng)過(guò)最初的延滯期后，細(xì)胞終密度達(dá)到3×106細(xì)胞/ml，和在轉(zhuǎn)瓶(Spinner Flask)中所獲得的最大細(xì)胞密度類(lèi)似。 2L和 10L培養(yǎng)體積的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況類(lèi)似，因此顯示出良好的可放大性（圖12）。

 

    Vero細(xì)胞在Cytodex 1和Cytodex 3微載體上無(wú)血清培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)

 

    接種量為4×105細(xì)胞/ml 的Vero細(xì)胞在含有2 L無(wú)血清培養(yǎng)基的Cellbag-10 L中的分別進(jìn)行Cytodex 1和 Cytodex 3培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)間歇搖動(dòng)混合6 h (16 rpm和4.5º下2 min, 然后0 rpm和 0º 停止搖動(dòng)18 min)。圖13A顯示Vero細(xì)胞在Cytodex 3上培養(yǎng)6 h 后完全鋪展，但是在Cytodex 1上細(xì)胞沒(méi)有鋪展開(kāi)來(lái)（圖 13 B）。為了提高Vero細(xì)胞在 Cytodex 1上的鋪展，培養(yǎng)物停止搖動(dòng)2 h，改進(jìn)了細(xì)胞在Cytodex 1上鋪展?fàn)顩r（圖13 C）。之后，在 37℃下兩種培養(yǎng)物都采用連續(xù)搖動(dòng)的方式繼續(xù)培養(yǎng)（11 rpm和4.5º）。

 

 

    Vero細(xì)胞也可以在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行微載體培養(yǎng)。如圖 14 所示，在無(wú)血清條件下，WAVE 和轉(zhuǎn)瓶這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中可以獲得基本相同的最大細(xì)胞密度。相比 Cytodex3，Cytodex  1 具有更大的表面積，因而得到更高的細(xì)胞密度。Vero細(xì)胞在WAVE  Bioreactor系統(tǒng)中培養(yǎng)過(guò)程中，接種 4天后細(xì)胞達(dá)到匯合。我們觀察到細(xì)胞在這兩種微載體上生長(zhǎng)迅速，無(wú)延滯期（圖14）；相比轉(zhuǎn)瓶而言，WAVE 反應(yīng)器中細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。

 

    透明的 Cytodex 微載體可以不經(jīng)染色直接鏡檢，使用臺(tái)盼藍(lán)染色可以快速觀察細(xì)胞是否達(dá)到交匯（圖 16）。活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜將會(huì)阻斷臺(tái)盼藍(lán)染料，并阻止微載體被染色。無(wú)細(xì)胞覆蓋的微載體很容易被染色，因此可以方便的看到細(xì)胞層中的缺陷或空洞。

 

 

    本研究發(fā)現(xiàn)WAVE  Bioreactor系統(tǒng)是一種可以成功用于 Cytodex 微載體培養(yǎng) MDCK 和 Vero細(xì)胞的通用生物反應(yīng)器。MDCK 和 Vero 細(xì)胞具有高的微載體貼壁率。我們發(fā)現(xiàn) WAVE Bioreactor系統(tǒng)和轉(zhuǎn)瓶對(duì)于MDCK和Vero細(xì)胞的最大細(xì)胞密度是相似的， 但WAVE中具有更快的生長(zhǎng)速度。對(duì)于微載體培養(yǎng)，建議最佳工作體積為最大Cellbag工作體積的20%到80%。 

    MDCK細(xì)胞

· 本研究獲得最大細(xì)胞密度為3×106細(xì)胞/ml，這與使用轉(zhuǎn)瓶在類(lèi)似的生長(zhǎng)條件下所獲得

的細(xì)胞密度相似。

· 我們使用類(lèi)似的搖動(dòng)混合條件，成功的將微載體培養(yǎng)從2 L放大到 10 L培養(yǎng)袋。

· 我們優(yōu)化了對(duì) Vero 細(xì)胞的接種貼壁操作程序，成功的在無(wú)血清條件下獲得 80%以上

的細(xì)胞貼壁率。

· Vero 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功的在Cytodex 1 和 3上進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得均勻的細(xì)胞分布，最終細(xì)胞在微載體上達(dá)到交匯。

· 在無(wú)血清條件下，Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到最大密度，約為1.4×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞密度與在轉(zhuǎn)瓶中生長(zhǎng)的 Vero 細(xì)胞相似，WAVE 具有更快的生長(zhǎng)速度。