Acumen eX3高內(nèi)涵細胞分析儀的細胞生物學應用（二）——癌癥相關(guān)研究

 

高通量細胞生物學是指將自動化儀器設(shè)備和細胞生物學技術(shù)整合，來回答傳統(tǒng)方法不能解決的問題。它需要用到先進的成像技術(shù)、化學試劑和生物學方法，快速、多通路地獲得細胞表型、功能和相互作用的信息。它的核心思想是盡可能多地獲得數(shù)據(jù)——無論是來源于大量樣本，還是采用“組學”的研究方式，同時不降低數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

 

英國TTP LabTech公司推出的Acumen eX3高內(nèi)涵細胞分析平臺配備有405nm、488nm和633nm三種不同波長的固態(tài)激光發(fā)生器，兼容眾多的熒光染料。Acumen eX3具有全孔高速成像和多重熒光分析的能力，兼有CCD成像系統(tǒng)和流式細胞儀的優(yōu)點，能在10min內(nèi)完成對微孔板（包括96、384、1536孔板）的整板掃描。目前，該平臺已經(jīng)成功地應用于各種細胞水平的研究，包括對人類基因組RNAi文庫的篩選研究1－3，癌癥相關(guān)的研究2（包括細胞周期、細胞增殖、克隆形成、細胞毒性、凋亡、細胞粘附、血管生成、蛋白激酶等），以及干細胞分化的研究³。特別值得一提的是，AcumeneX3的高質(zhì)量成像優(yōu)勢在組織切片、動物模型（如線蟲，果蠅和斑馬魚）等系統(tǒng)生物學研究領(lǐng)域也備受推崇。在過去短短的幾年里，Acumen eX3已經(jīng)成為科研和制藥領(lǐng)域最為推崇的高通量細胞生物學的研究利器之一。

 

 

癌癥研究的主要目的就是為了提供攻克癌癥的治療手段，那么也就離不開細胞水平的毒性、增殖與凋亡、侵襲遷移等分析，由于在眾多應用方面高內(nèi)涵技術(shù)和癌癥研究直接相關(guān)，這也使得高內(nèi)涵技術(shù)在癌癥相關(guān)研究中廣泛應用。Acumen eX3 作為高內(nèi)涵技術(shù)的革命性產(chǎn)品很好的將腫瘤學研究和高通量生物學結(jié)合起來，不僅應用領(lǐng)域覆蓋了包括蛋白激酶分析、細胞侵襲和遷移、細胞增殖、克隆形成、細胞毒性、凋亡、細胞粘附、血管生成等眾多癌癥研究的熱門領(lǐng)域4－7，而且還滿足了用戶在24至1536孔板上進行的高通量細胞水平實驗，并提供全孔細胞的精確數(shù)據(jù)分析。下面我們就從幾個應用領(lǐng)域來介紹Acumen eX3在癌癥研究中的優(yōu)勢。

 

1.      細胞周期

細胞周期調(diào)控的紊亂會引發(fā)多種疾病，特別是白血病和其他癌癥。因此，對人類細胞中參與周期調(diào)控的必需基因的研究不僅能加深對基礎(chǔ)生物學的了解，還可能為攻克癌癥帶來全新的診斷和治療方法。

 

Acumen eX3微孔板細胞分析儀（TTP LabTech）提供了流式細胞儀無法比擬的細胞周期篩選通量。通�？稍�10分鐘內(nèi)讀取一整塊384孔板，并且同時進行多重分析，如有絲分裂指數(shù)的確定。Acumen eX3能原位分析貼壁細胞，而不需要像流式細胞儀那樣重懸細胞，這就避免了細胞在重懸的時候因為形態(tài)變化而影響實驗結(jié)果。使用細胞通透性DNA染料可以實現(xiàn)細胞周期分析以及其他生物標記物的多重分析。

圖1 對長春堿處理細胞的細胞周期和有絲分裂指數(shù)的多重分析

 

2. 克隆形成實驗

細胞的克隆形成實驗被廣泛應用于癌癥的臨床和機理研究中，人們以此來評價細胞群體在體外的功能狀況。其中一些重要的研究領(lǐng)域就包括了細胞毒性評估、細胞轉(zhuǎn)化研究以及預測腫瘤細胞對各種化學治療試劑的反應。過去，克隆計數(shù)實驗是在半固體的瓊脂糖雙層系統(tǒng)上進行的，需要在顯微鏡下一個一個地數(shù)，非常費時費力，并且無可避免的引入了人為的主觀因素的影響。一般的高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)，由于景深有限，不能準確分辨大體積的克��；而且它的成像面積較小，又不能對全孔進行克隆計數(shù)。

 

Acumen eX3 能夠自動地對24 或96 孔板進行高內(nèi)涵的全孔掃描，軟件獨有的體積算法能精確測量克隆大小。細胞經(jīng)過calcein-AM 染色后，可在選定的時間點來監(jiān)測克隆的生長，精確區(qū)分孔內(nèi)含有指定細胞數(shù)量的克隆，這能幫助用戶區(qū)分細胞簇和克隆，從而精確計數(shù)。一般來說，細胞克隆被認為含有20 個以上的細胞（圖2，紅色），而細胞簇不足20 個細胞（圖2，綠色）。傳統(tǒng)的格子計數(shù)法對于某些克隆來說就會顯得無計可施（如圖2中的克隆2）。而Acumen eX3 鑒定了孔中的所有熒光目標，這也意味著所有克隆都能被準確地鑒定和分類。在表1中顯示了圖2中標記的3 個克隆的面積和體積測量結(jié)果（表1）。通過比較可以發(fā)現(xiàn)，使用面積作為測量參數(shù)相對于使用體積作為測量參數(shù)，低估了克隆的尺寸。例如，克隆2 由于其形狀和在孔中的分布方向所致，使得它的體積/面積比要遠遠大于克隆1 和克隆3。

圖2Acumen eX3 軟件對細胞克隆的鑒定及分類

表1  Acumen eX3 計算的3個克隆的相關(guān)參數(shù)

 

顯然Acumen eX3這種利用體積讀數(shù)來對細胞克隆形成進行評估的方法，避免了由于細胞毒性等引起細胞在數(shù)目和外形上的不同而造成的誤差，無疑提供了一種優(yōu)異的檢測克隆形成的實驗方法⁶。

 

3. 血管生成實驗

血管生成（angiogenesis）是癌癥轉(zhuǎn)移所必需的條件，腫瘤的血管生成是指血管網(wǎng)絡(luò)的增殖，這些血管滲透到癌細胞周圍，為之提供營養(yǎng)和氧氣，并帶走廢物。腫瘤的血管生成實際受所釋放的生長因子的調(diào)控。這些信號激活了宿主組織中的某些基因，翻譯生成的蛋白會促進新血管的生長。因而科學家一直寄希望于能夠通過干擾腫瘤的血管生成來治療癌癥。

 

Acumen eX3的大視野能力支持24或96多種規(guī)格的微孔板。在生長因子刺激后，細胞用calcein-AM 染色，通過Acumen eX3掃描后，血管生成的數(shù)量就可輕松確定⁸。軟件會得到總的血管面積；也可以將圖像輸出，由Image Pro Plus進行血管長度以及分支數(shù)量的測定。

4. 細胞遷移實驗

細胞遷移是高度整合、復雜調(diào)控的過程，細胞遷移的調(diào)控異常涉及到癌癥、黃斑退化和糖尿病、傷口愈合等多種疾病。腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤的基本生物學特征，因此腫瘤細胞遷移的研究對癌癥的防止有著重要的意義。近年來，關(guān)于評估細胞遷移的實驗方法越來越精細，取代了之前Boyden 小室方法。

Acumen eX3結(jié)合Oris™細胞遷移分析（http://www.platypustech.com）的專利技術(shù)實現(xiàn)了在在微孔板上進行細胞遷移實驗，利用獨特的細胞接種塞來產(chǎn)生一個能觀察細胞遷移和侵襲的檢測區(qū)域。硅膠塞插入96 孔板的每個孔中，接種后4-18 個小時，貼壁細胞附著在硅膠塞以外的區(qū)域，形成一個環(huán)。去除硅膠塞后，孔中心形成直徑2 mm的圓形區(qū)域沒有附著任何細胞，區(qū)域外的細胞會向內(nèi)遷移，此區(qū)域即可用于檢測細胞遷移的速率。

圖5 Oris™細胞遷移板在Acumen eX3 上進行的分析，并支持多種熒光標記。

 

由于Acumen eX3在成像面積和計數(shù)效率方面的優(yōu)勢，大大提高了整個實驗的效率，96孔板掃描分析不超過10分鐘。更重要的是避免了傳統(tǒng)的劃痕法引入的人為操作誤差^9-10。