5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA） ELISA試劑盒使用說明

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5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA） ELISA試劑盒使用說明

（德國(guó)IBL：RE59131）

1、應(yīng)用范圍

此ELISA試劑盒可用于人尿液中5-HIAA的體外定量檢測(cè)。

2、前言

原發(fā)性類癌瘤通常都源自中腸的腸嗜鉻細(xì)胞，并且大多情況都位于回腸末端中。類癌瘤通常都會(huì)分泌各種各樣的吲哚，此類腫瘤的一般都明顯的表現(xiàn)為尿液5-HIAA（五羥色胺的最終代謝產(chǎn)物）的分泌量升高。5-HIAA傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是通過亞硝基萘酚的重氮化作用產(chǎn)生紫色。然而，人們已證明很多存在于尿液中的其它物質(zhì)會(huì)干擾此反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。人們也嘗試著通過將離子交換層析和熒光分析相結(jié)合的方法來克服此問題。但這些方法靈敏度低并且耗費(fèi)時(shí)間。最近，有人也介紹使用下列方法來檢測(cè)5-HIAA：紫外區(qū)域5-HIAA的高效液相層析與熒光分析（或電化學(xué)分析）相結(jié)合的方法。因?yàn)槟蛞褐写嬖谥鞣N各樣的干擾復(fù)合物，所以這兩種方法都要求進(jìn)行溶劑提取。而5-HIAA的酶聯(lián)免疫檢測(cè)是用于尿液中類腫瘤綜合征標(biāo)記物定量檢測(cè)的一種全新的、簡(jiǎn)單的方法。

3、實(shí)驗(yàn)原理

此ELISA試劑盒利用的是競(jìng)爭(zhēng)法原理，生物素標(biāo)記抗原和未用生物素標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的抗體結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合到抗體上生物素標(biāo)記抗原的量與樣品中被分析物的濃度成反比。反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，未結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗原用洗滌液洗去。結(jié)合了生物素標(biāo)記抗原的抗體的量的測(cè)定是以抗生物素堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，以PNPP(對(duì)硝基苯酚磷酸鹽)作為底物液。將未知物的酶反應(yīng)活性和已知標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線相比較，可以得到未知物的量。

4、試劑盒成分

數(shù)量	標(biāo)志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克�。�。
1×5ml	ANTISERUM	5-HIAA 抗血清藍(lán)色，即用，內(nèi)含：抗血清（兔），磷酸緩沖液，穩(wěn)定劑。
1×5ml	BIOTIN	5-HIAA 生物素即用，藍(lán)色，內(nèi)含：磷酸緩沖液，穩(wěn)定劑。
1×0.2mL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物濃縮型（100×）內(nèi)含：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體（羊），Tris緩沖液，穩(wěn)定劑
1×7×0.5ml	CAL A-G	標(biāo)準(zhǔn)品A-G 0; 0.4; 1.0; 2.75; 7.5; 20; 55 mg/L 0; 2.1; 5.25; 14.4; 39.4; 105; 288 μmol/L 即用,內(nèi)含:5-HIAA（甲基化）,穩(wěn)定劑。
1×2×0.5ml	CONTROL 1+2 LYO	質(zhì)控品1+2，凍干粉，內(nèi)含：人尿液（正常與非正常人的尿液），具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽.
1×2ml	METHYLRAGE	甲基化試劑，黃色，即用，內(nèi)含二氯甲烷
1 x 1 mL	HCL	HCl，即用，0.1M的HCl
1 x50ml	ASSAUBUF CONC	檢測(cè)緩沖液，濃縮（10 x）內(nèi)含：磷酸緩沖液，BSA，穩(wěn)定劑
1 x4ml	DILREAG	稀釋液，即用，內(nèi)含：N,N-二甲基甲酰氨
1 x50ml	WAHSBUF CONC	洗滌液，濃縮（20 x）內(nèi)含：磷酸緩沖液，吐溫，穩(wěn)定劑
1×9	PNPP SUBS	PNPP底物片，內(nèi)含：對(duì)硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含：二乙醇胺，水，
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內(nèi)含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
3×	FOIL	粘性金屬板

5、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）

移液器（20；25；50；100；1000μL）

玻璃檢測(cè)用試管（12×75mm）

旋渦混合器

帶儲(chǔ)器的8通道移液器

洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)包被板清洗系統(tǒng)

酶標(biāo)儀

雙蒸水或去離子水

通風(fēng)櫥

吸水紙，取樣吸頭，計(jì)時(shí)器

6、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說明

供手動(dòng)操作和自動(dòng)操作用：

注意	此96人份的檢測(cè)試劑可分成3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。下列體積為用四條包被板（32人份）進(jìn)行一次檢測(cè)所需要的試劑的量。如果客戶想將標(biāo)準(zhǔn)品的量由7個(gè)減為6個(gè)，您可去掉標(biāo)準(zhǔn)品G。則實(shí)驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告范圍相應(yīng)的減少到3000μg/L

6.1凍干粉或濃縮成分的制備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
15ml	檢測(cè)緩沖液	150ml	雙蒸水	1：10	充分混合	2-8℃	2周
	炙控品	0.5ml	0.1M的HCl		靜置15min，混合時(shí)避免氣泡	≤-20℃	8周
15ml	洗滌液	300ml	雙蒸水	1：20	加熱至37℃以溶解所有的晶體（如果有必要），充分溶解。	2-8℃	4周
60μL	酶聯(lián)物	60ml	檢測(cè)緩沖液(已稀釋好)	1：101	臨時(shí)配置，僅能使用一次，混合時(shí)避免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	30min
3	PNPP底物片	8ml	PNPP底物液緩沖液		臨時(shí)配置，僅能使用一次,混合時(shí)必免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	10min

6.2樣品的稀釋

樣品中5-HIAA膿渡高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)在甲基化后用檢測(cè)緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。

7、第一天

7.1質(zhì)控品和病人樣品的稀釋（除標(biāo)準(zhǔn)外）

樣品的準(zhǔn)備將導(dǎo)致255倍的稀釋。但這已將此考慮到標(biāo)準(zhǔn)品濃渡中。

注意	不要甲基化標(biāo)準(zhǔn)品，它已經(jīng)被甲基化了。
1）	將質(zhì)控品和樣品分別20μL加入到相應(yīng)的玻璃試管中。
2）	完成次操作步驟后，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥內(nèi)繼續(xù)操作。
3）	在每一支試管中加入50μL稀釋液。旋渦混合器上混合。
4）	在每一試管中加入25μL甲基化試劑。加入試劑后立即混合試管內(nèi)溶液。注意：反應(yīng)混合物的黃顏色應(yīng)當(dāng)持續(xù)穩(wěn)定，如果顏色迅速消失說明樣品中酸的量過大。在這種情況下在向試管中加20μL甲基化試劑。
5）	蓋好試管，室溫（18-25℃）下溫育20min
6）	在每一試管中加入5ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液。用塞子蓋好是試管并旋轉(zhuǎn)幾次。手動(dòng)或用混合器上下混合最少五次，以便液體能充分混合。
7）	完成此步驟后就可以不要才通風(fēng)櫥下操作了。
8）	吸取50μL上清液，立即進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。上清液室溫下可穩(wěn)定存放1h。

8.2 ELISA操作

1）	將標(biāo)準(zhǔn)品、甲基化質(zhì)控品和甲基化病人樣品分別50μL加入到相應(yīng)的微孔。
2）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA生物素。
3）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA抗血清。
4）	蓋板，小心振動(dòng)包被板。2-8℃下溫育一夜（16-20h）。

8、第二天

1）	移去金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，用250μL洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
2）	每孔加入150μL臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物
3)	用一新的粘性金屬蓋板。室溫環(huán)境（18-25℃）下，在軌道搖床（500rpm）上溫育120min.
4)	在溫育結(jié)屬前大約10min的樣子時(shí)，向微孔中加入酶聯(lián)物。
5）	移去金屬板，棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，用250μL已稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
6）	在加入底物液和終止液時(shí)，如果有條件的話，可使用8道移液器進(jìn)行加液。加底物液和終止液必須按相同的時(shí)間間隔進(jìn)行，避免氣泡產(chǎn)生。
7）	在每一微孔中加入200μL臨時(shí)配置好的PNPP底物液。
8）	室溫（18-25℃）環(huán)境下，在軌道搖床上溫育60min。
9）	在每一微孔中加入50μL PNPP終止液以終止反應(yīng)。輕輕搖動(dòng)包被板以混合各種成分。
10）	加入終止液后60min之內(nèi)在405nm處測(cè)OD值（參考波長(zhǎng)：600-650nm）。