454高通量測(cè)序——研究土壤微生物的新手段
在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，在土壤中生活有數(shù)量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌及超顯微結(jié)構(gòu)微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍(lán)藻除外) 、地衣等。它們與植物和動(dòng)物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，擔(dān)負(fù)著地球C、N、P、S 等物質(zhì)循環(huán)的“調(diào)節(jié)器”[1]、土壤養(yǎng)分植物有效性的“轉(zhuǎn)化器”和污染環(huán)境的“凈化器”等多方面生態(tài)功能[2]。土壤微生物是氣候和土壤環(huán)境條件變化的敏感指標(biāo)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態(tài)特征多樣性和功能多樣性[3]。由于土壤微生物的復(fù)雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對(duì)土壤微生物多樣性的研究與動(dòng)、植物相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。隨著多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測(cè)序等現(xiàn)代生物學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 人們對(duì)土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數(shù)據(jù)，為直接探究土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)提供了客觀而全面的信息。
一、對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究的方法
1、微生物平板培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現(xiàn)型來分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。
這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養(yǎng)的微生物類群，無法對(duì)絕大多數(shù)微生物的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的深入研究。
2、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合測(cè)序的方法
在過去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其16SrDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定未知菌的研究中。20世紀(jì)80年代以來, 逐步建立起了以分子系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩(wěn)定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對(duì)土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。
其中運(yùn)用比較廣泛并被普遍認(rèn)可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測(cè)的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測(cè)[4]，PCR 擴(kuò)增所需G/C 堿基對(duì)含量至少達(dá)40 % ，通常只能檢測(cè)到環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌群的存在，只有占整個(gè)群落細(xì)菌數(shù)量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測(cè)到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因?yàn)榻咏?0 ℃而使檢測(cè)難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現(xiàn)序列不同的DNA 遷移在同一位置的現(xiàn)象。
3、高通量測(cè)序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600堿基的序列，足以對(duì)環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進(jìn)行初步的估計(jì)[8]，因此454高通量測(cè)序的方法因其讀長（400~500bp）長和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)大量用于微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。Gen Bank將按照與測(cè)得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對(duì)應(yīng)的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測(cè)序的優(yōu)越性體現(xiàn)在：測(cè)序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區(qū)域； 測(cè)序通量高，可以檢測(cè)到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實(shí)驗(yàn)操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)；無需進(jìn)行復(fù)雜的文庫構(gòu)建，微生物DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測(cè)序，實(shí)驗(yàn)周期短；測(cè)序數(shù)據(jù)便于進(jìn)行生物信息分析。
該方法得到頂級(jí)期刊的認(rèn)可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測(cè)的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。高通量測(cè)序因其數(shù)據(jù)量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作過程所造成的樣本損失，能夠相對(duì)客觀的反應(yīng)出土壤樣本的真實(shí)情況。
二、高通量測(cè)序在土壤微生物研究中的應(yīng)用
1.1 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對(duì)微生物類群即細(xì)菌、真菌和放線菌這三大類群的數(shù)量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數(shù)量來研究土壤微生物多樣性，如對(duì)土壤中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進(jìn)行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454測(cè)序法對(duì)西半球的一個(gè)大的橫斷面的4類土壤進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農(nóng)業(yè)土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測(cè)結(jié)果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點(diǎn)所有序列的0.009%，而農(nóng)業(yè)土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細(xì)菌的多樣性差距非常大，因土壤結(jié)構(gòu)的不同土壤中的細(xì)菌群體也呈現(xiàn)出多樣化。Triplett等[10]基于焦磷酸測(cè)序法來對(duì)16S rRNA的V2-V3區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，估測(cè)9個(gè)草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對(duì)所有752,838條數(shù)據(jù)序列進(jìn)行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發(fā)現(xiàn)在不同的土壤層中，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質(zhì)有關(guān)的，包括有機(jī)碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
1.2 研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養(yǎng)元素在土壤中轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能等，通過分析測(cè)定土壤中的一些轉(zhuǎn)化過程, 如有機(jī)碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應(yīng)是硝化作用的第一步，也是全球氮循環(huán)中由微生物活動(dòng)形成硝化鹽的重要進(jìn)程。Leininger[11]檢測(cè)了3個(gè)氣候區(qū)域12塊原始和農(nóng)業(yè)用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個(gè)亞基的基因豐度。采用反向轉(zhuǎn)錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)互補(bǔ)DNA測(cè)序，證實(shí)古細(xì)菌的氨氧化活性要遠(yuǎn)高于細(xì)菌，證實(shí)Crenarchaeota可能是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法同時(shí)獲得土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和功能信息。結(jié)果認(rèn)為，通過該方法可以同時(shí)研究微生物生種群結(jié)構(gòu)與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學(xué)分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達(dá)特征之間的關(guān)系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時(shí)也需要運(yùn)用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)起來。對(duì)rRNA表達(dá)基因和與環(huán)境因素相關(guān)的主要酶類的基因進(jìn)行定量化和比較分析，將能了解微生物結(jié)構(gòu)與特定功能之間的關(guān)系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環(huán)過程的重要流程之一。通過宏基因組測(cè)序的方法，結(jié)合分子檢測(cè)和焦磷酸測(cè)序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個(gè)土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離并鑒定了9個(gè)參與反硝化作用的酶簇[13]。
1.3 研究環(huán)境的突然變化對(duì)土壤微生物菌群的影響
環(huán)境的突然改變會(huì)導(dǎo)致微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。Zachary等[14]以重水穩(wěn)定同位素探測(cè)技術(shù)（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關(guān)的細(xì)菌。通過液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結(jié)合到了所有的DNA結(jié)構(gòu)成分中。盡管這種結(jié)合不是均勻的，還是可以明顯的將標(biāo)記了18O和未標(biāo)記的DNA區(qū)分開來。作者發(fā)現(xiàn)DNA和細(xì)胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發(fā)生交換，表明摻入DNA的18O是相對(duì)穩(wěn)定的，并且摻入到細(xì)菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕后，對(duì)土壤中16S rRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對(duì)比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)行研究和生態(tài)類群的劃分。
注：已用454焦磷酸測(cè)序法發(fā)表的文章總結(jié)
1、Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils
—— (2006) Nature 442: 806-809——if 36.101
2、454 Pyrosequencing analyses of forest soils reveal an unexpectedly high fungal diversity.
——(2009) New Phytologist 184(2): 449-56.——if 6.516
3、Vertical distribution of fungal communities in tallgrass prairie soil.
——(2010) Mycologia 102(5): 1027-41.——if 6.2
4、A comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses.
——(2009) ISME Journal 3(4): 442-53——if 6.153
5、Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity
——(2008) The ISME Journal 1: 283–290——if 6.153
6、Bacterial diversity in rhizosphere soil from Antarctic vascular plants of Admiralty Bay, maritime Antarctica.
——(2010) ISME Journal 4(8): 989-1001.——if 6.152
7、Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples.
7、Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples.
——(2010) FEMS Microbiology Letters 307(1): 80-6.——if 6.152
8、Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil.
——(2010) ISME Journal ePub:——if 4.42
9、Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil.
—— (2010) ISME Journal ePub: ——if 4.42
10、Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome .
—— (2008) PloS One 3:——if 4.411
11、Characterization of trapped lignin-degrading microbes in tropical forest soil.
——(2011) PLoS One 6(4): e19306.——if 4.411
12、Impact of biochar application to soil on the root-associated bacterial community structure of fully developed greenhouse pepper plants.
——(2011) Appl Environ Microbiol ePub:——if 3.8
13、Validation of heavy-water stable isotope probing for the characterization of rapidly responding soil bacteria.
13、Validation of heavy-water stable isotope probing for the characterization of rapidly responding soil bacteria.
——(2011) Appl Eviron Microbiol ePub:——if 3.8
14、Identification of Nitrogen-Incorporating Bacteria in Petroleum-Contaminated Arctic Soils Using 15N DNA-SIP and Pyrosequencing.
14、Identification of Nitrogen-Incorporating Bacteria in Petroleum-Contaminated Arctic Soils Using 15N DNA-SIP and Pyrosequencing.
——(2011) Appl Environ Microbiol ePub: ——if 3.8
15、Pyrosequencing-based assessment of bacterial community structure along different management types in german forest and grassland soils.
——(2011) PLoS One 6(2): e17000.——if 3.8
16、Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing.
——(2010) Journal of Microbiology 48(3): 284-9.——if 3.8
17、Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach.
17、Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach.
——(2009) Environmental Microbiology ePub:——if 3.778
18、Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil.
Feinstein LM, Sul WJ, Blackwood CB. (2009) Appl Environ Microbiol 75(16): 5428-33.——if 3.778
19、Characterization of denitrification gene clusters of soil bacteria via a metagenomic approach.
——(2009) Applied Environmental Microbiology 75(2): 534-7——if 3.778
20、Tag-encoded pyrosequencing analysis of bacterial diversity in a single soil type as affected by management and land use.
20、Tag-encoded pyrosequencing analysis of bacterial diversity in a single soil type as affected by management and land use.
——(2008) Soil Biology and Biochemistry 40: 2762-2770——if 3.242
21、Shifts in microbial community structure along an ecological gradient of hypersaline soils and sediments.
——(2010) ISME Journal 4(6): 829-38.——if 2.039
22、Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction approaches.
——(2011)Microbiol Methods ePub: ——if 2.018
23、Horizon-specific bacterial community composition of German grassland soils as revealed by pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes.
—— (2010) Appl Environ Microbiol 76(20): 6751-9.
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454高通量測(cè)序
土壤微生物
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