生物標志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達分析功能學檢測RealTime ready 應用
生物標志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達分析功能學檢測RealTime ready應用
Sabine Lohmann*, Andrea Herold*, Tobias Bergauer#, Anton Belousov+, Gisela Betzl *, Manuel Dietrich*, Manuela Poignée-Heger *, David Geho’, Martin Weisser+
*Roche Applied Science, Penzberg, 德國
+Roche Pharma, Penzberg, 德國
#Roche Pharma, Basel, 瑞士
’Roche Pharma, Nutley, 美國
前言
生物標志物與早期臨床藥物研發(fā)抗-TWEAK復合物研發(fā)舉例
TWEAK（腫瘤壞死因子樣細胞凋亡弱誘導因子）是一種多功能細胞因子，可控制包括細胞增殖、遷移、分化、凋亡、血管生成，以及炎癥在內(nèi)的多種細胞活動。TWEAK通過與Fn14結(jié)合發(fā)揮作用，F(xiàn)n14 是一種具有高度誘導性的細胞表面受體，與包括細胞核因子- kB（NF-kB）途徑在內(nèi)的多種細胞內(nèi)信號途徑具有相關性（2）。
|
Anti-TWEAK (RO5458640) 是一種直接針對TWEAK的重組人化 IgG1κ單克隆抗體。RO5458640 可與 TWEAK 結(jié)合，從而阻斷 TWEAK 與受體結(jié)合。Fn14：抑制TWEAK：Fn14 信號途徑與相應下游作用可促進腫瘤生長 (3)。
TWEAK 可與細胞外受體 Fn14 結(jié)合，通過 NF-κB 途徑， TWEAK與 Fn14 的結(jié)合可誘導信號轉(zhuǎn)導。 |
根據(jù)文獻搜索與TWEAK信號轉(zhuǎn)導途徑生物學芯片數(shù)據(jù)，應用“關鍵詞”搜索功能，于RealTime ready配置門戶網(wǎng)完成一個RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測板的配置。為生成首個假設，使用RealTime ready NF-kB panel，于9種不同的腫瘤細胞系（經(jīng)過處理細胞系對未處理細胞系，于不同時間點，共使用 54 份樣本）中，進行體外基因表達分析。根據(jù)細胞系結(jié)果，使用簡化 NF-kB panel（35種參數(shù)），確認體內(nèi)小鼠移植模型中的潛在生物標志物�；诩毎蹬c移植物測定結(jié)果，鑒定出13種潛在性、候選基因。為對假設進行檢驗，從上述參數(shù)中篩選出 6 種參數(shù)，進行人FFPE樣本分析。上述6種參數(shù)與所選參考基因適合于感興趣的實體腫瘤（BC、CRC、NSCLC、肉瘤、RCC）。已經(jīng)開發(fā)出RealTime ready qPCR檢測，并已經(jīng)進行FFPET RNA分離功能的優(yōu)化。
個體化醫(yī)療（PHC）根據(jù)基因信息，針對個體的遺傳獨特性，對個體進行衛(wèi)生保健、疾病預防與治療服務，滿足個體需要。對特定生物狀態(tài)指示劑的生物標志物分子的識別與鑒定，在個體化醫(yī)療中具有重要作用（1）。因此，生物標志物是藥物從靶點鑒定至藥物應用生命周期的核心元素。前列腺素特異性抗原
（PSA）、c-反應蛋白（CRP），與HER2/neu僅是眾多生物標志物分子中的少數(shù)幾個。
生物標志物研究中，人們對復雜生物背景下mRNA表達研究抱有濃厚興趣。RealTime ready RT-qPCR檢測與RealTime ready 配置門戶網(wǎng)站在線完成相關標志物基因的選擇，qPCR功能檢測有助于了解基因表達概況。LightCycler®480多孔板上RealTime ready 定制型檢測多孔板上含有用戶選擇的、預置人、小鼠或大鼠靶序列qPCR檢測(https://configurator.realtimeready.roche.com)。我們已經(jīng)建立起細胞系（體外）、移植小鼠模型（體內(nèi)），與各種人類研究樣本FFPET切片生物標志物研究的基因表達分析工作流。
|
生物標志物研究RealTime ready qPCR檢測�？蓾M足不同檢測質(zhì)量要求。生物標志物在治療性藥物復合物研發(fā)周期全程均非常重要（TWEAK復合物研發(fā)僅是一個例子。LightCycler® 480 real-time PCR 平臺聯(lián)合使用。
|
于標準條件下進行腫瘤細胞系（ACHN、Caki、SJSA、PANC-1、MDA-MB231、AsPC-1、SK-MES、NCI-H322M、22RV1）培養(yǎng)。使用TWEAK或 Anti-TWEAK（RO5458640）分別對細胞進行處理。于不同時間點收集腫瘤細胞系（0、6、24 小時），將RNA樣本存放（Qiagen）。
細胞 RNA 分離
使用MagNA Pure LC 儀、MagNA Pure LC RNA Kit –High Perfor-mance（Roche，貨號：03 542 394 001），與MagNA Pure LC 程序“RNA HP Cells”從細胞小球中分離總體細胞 RNA。溶解并混合細胞裂解物（1 x 106細胞每 600 µl RLT 緩沖液[Qiagen，貨號：79216]），并將 2 x 200 µl細胞裂解物轉(zhuǎn)移至MagNA Pure Sample Cartridge wells（200 µl每孔）。洗脫裂解液重復分離制備的 RNA 至 50 µl，并收集洗脫液。FFPE 組織 RNA 分離使用 High Pure RNA Paraffin 試劑盒（Roche，貨號： 03 270 289 001），根據(jù)操作手冊（福爾馬林固定、石蠟包埋組織 RNA 分離方案），從10um FFPET 切片中分離總體細胞 RNA, 經(jīng)過調(diào)整的技術操作步驟如下：1 x 蛋白酶 K 85°C 消化 30 分鐘；第二次添加蛋白酶 K 55°C 消化 30 分鐘；室溫 High Pure 柱上DNase處理 15 分鐘。經(jīng)過調(diào)整的技術操作步驟更加快速、上機時間更短，顯示其性能具有可比性。
使用NanoDrop儀器進行RNA制備物質(zhì)量與定量分析。使用Agilent生物分析儀與RNA Nano芯片進行某些樣本RNA完整性分析。
cDNA合成
使用Transcriptor Universal cDNA Master（Roche，貨號：05 893 151 001）與 1ug 總體RNA進行cDNA合成。每份樣本均建立3份獨立的40µl反應液。逆轉(zhuǎn)錄系列RNA稀釋液，并分別進行濃縮產(chǎn)物PCR。
實時qPCR
進行 1g 總 RNA 3 份cDNA合成反應混合液、稀釋處理，并將其作為模板，用于RealTime ready Custom Panel Plate, 384（Roche，貨號：05 582 873 001）。使用LightCycler® 480 Probes Master（Roche，貨號：04 707 494 001）進行含有RNA的反應混合物制備。
每孔總體PCR反應容積是10 µl，終RNA容量是10ng。羅氏公司為每個儀器配備有LightCycler® 480 軟件，版本1.5，以及content.txt文件，從而使樣本設置與結(jié)果分析更加容易。
|
工作流描述：NF-κB RealTime ready 定制型多孔檢測板體外研究
http://www.uniklinik-freiburg.de/augenklinik/live/homede/Angiogenese/amd.html?raw=true&layout=weiss&szsrc= |
對于相關定量分析來說，通過參考基因表達進行靶基因表達標準化。理想情況下，標準化處理應該能夠補償 RNA/cDNA起始量變異情況，以及cDNA合成或 PCR 擴增中潛在抑制劑的作用。參考基因作為內(nèi)源性樣本材料對照，工作流中，與靶基因一同被處理。為獲取可靠結(jié)果，標準化中選擇合適的參考基因非常重要。合適參考基因即：在感興趣的樣本中，性能比較穩(wěn)定的、非表達調(diào)節(jié)基因（4，5）。如圖 1，于 4 個參考基因中選擇出 2 個基因作為參考基因。
 圖 1：9 種細胞系 4 種參考基因表達分析。本研究 9 種細胞系 4 種參考基因絕對Cq值（重復檢測）作圖。使用同樣cDNA混合液進行PCR。分析 顯示，兩個參考基因模式相似，參考基因為：ALAS1 （氨基酮戊酸鹽、Δ-、合成酶 1）與 HPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 1）。第 3 個基因：MRPL19（線粒體核糖體蛋白 L19）性能非常具有可比性，第 4 個基因：G6PDH（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶），具有獨特模式。因此，我們將 ALAS1 與 HPRT 作為參考基因，進行相關基因表達分析。 |
各種實體腫瘤 9 種細胞系 NF-kB panel與 RNA 基因表達分析中，通過Cq值標準化處理，以及聯(lián)合使用 2 個參考基因（RG），確認出 35 個差異表達基因。Δ Cq計算如下：Cq_RG – Cq_靶值，Cq_RG是參考基因：ALAS 與 HPRT Cq均值。9 種細胞系 TWEAK 受體（Fn14）差異表達模式見圖 2
應用治療復合物后，藥效學生物標志物（功能性生物標志物）會發(fā)生改變，并顯示治療反應（6）。確定治療復合物相關劑量非常重要。參數(shù)選擇后，使用體內(nèi)小鼠模型，對體外確定的假設生物標志物進行驗證。使用移植物來源的新鮮凍存（FF）組織樣本對所選生物標志物進行檢測。圖4顯示相關安慰劑對照的抗- TWEAK 處理移植物小鼠潛在藥效學生物標志物相關基因表達比率。研究發(fā)現(xiàn)，用藥后，基因表達降低。
 圖 2：9 種細胞系TWEAK受體基因表達。相關比率（log 2 量表）計算如下：ΔCq = Cq_HK – Cq_Fn14。以細胞系與時 間點作圖。進行 ALAS1 與 HPRT1 標準化處理。 ACHN：人腎細胞腺癌 Caki：人腎透明細胞癌細胞系 SJSA：人骨肉瘤；多源肉瘤 PANC-1：人胰腺癌；上皮樣細胞系 MDA-MB 231：人乳腺癌模型；乳房；乳腺；胸腔積液 AsPC-1：人胰腺腺癌 SK-MES-1: 人肺癌 NCI-H322M: 細支氣管肺泡腺癌 22RV1: 人前列腺癌移植片細胞系 |
反應性預測（臨床反應）生物標志物可顯示：個體對治療性復合物是否會產(chǎn)生最佳反應性（6）。著名事例：HER2/neu與Herceptin。
確認潛在反應性預測生物標志物，所選9種細胞系相關基因表達（參見圖 2）與小鼠模型移植腫瘤生長抑制之間具有相關性。1或24小時收集的細胞系為未處理細胞系，使用抗-TWEAK進行小鼠處理。細胞系基因表達結(jié)果表明，重現(xiàn)性非常高，處理時間或培養(yǎng)對表達結(jié)果無影響。小鼠模型腫瘤生長抑制（TGI）與細胞系潛在生物標志物相關基因表達之間相關性較高，見圖3。
 圖 3：細胞系中反應性預測生物標志物 1 基因表達與體內(nèi)腫瘤生長抑制(TGI)結(jié)果之間相關性較高。RealTime ready NF-κB 定制型多孔檢測板中基因表達結(jié)果與體內(nèi) TGI 作圖�！吧飿酥疚�1”基因表達增加與 TGI 具有相關性。 |
|
|
圖 4：體內(nèi)小鼠移植片模型中，抗- TWEAK 治療反應與潛在生物標志物 2 相關基因表達比率作圖。log 2 量表（n = 5 只動物）基因表達中值作圖。我們使用的第一套臨床樣本來自于各種用于人類研究的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織。腫瘤來源的 FFPE 組織是臨床試驗或生物標志物研究中，治療復合物研發(fā)最具有相關性的樣本材料。使用 High Pure RNA Paraffin 試劑盒，從 FFPE 組織（例如：10um切片）中提取RNA，修訂操作方案見“材料與方法”
章節(jié)的描述，其后是特異性優(yōu)化與功能學檢測RealTime ready RT-qPCR分析。
|
A) 生物標志物 3/腎隨機引物 |
B) 生物標志物 3/FFPET BC隨機引物 |
C) 生物標志物 3/FFPET BC特異性引物 |
 |
 |
 |
|
圖 5：潛在“生物標志物 3”RealTime ready qRT-PCR 擴增曲線。來自腎 RNA（A）與 FFPE 乳腺癌（BC）樣本（B 與 C）系列稀釋 RNA 模板。使用 250 ng，最低含量 0.4 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應混合物（A 與 B），或 100 ng，最低含量 0.16 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應混合物（C）進行 PCR 啟動。C中，使用特異性引物而不是隨機引物進行cDNA合成啟動，以提高靈敏性。 | ||
FFPE研究樣本假設檢驗中，可成功應用RealTime ready RT-qPCR
檢測。已經(jīng)確立并對不同樣本工作流程方案進行描述。使用
High Pure RNA Paraffin試劑盒，可從FFPE組織樣本中分離出RNA，
通過RealTime ready檢測，可進行qRT-PCR分析。
2. Winkles, J. A. (2008) Nature Reviews, Drug Discovery 7(5): 411–25.
3. RDR report # 1042689 (Draft vers. April 2011)
4. Bustin, S.A., et al. (2009) Clin Chem 55 (4): 611.
5. Vandesompele, J. et. al. (2002) Genome biology 3 (7)
6. de Koning, P. & Keirns, J. (2009) Biomarkers Med 3(6): 685–700.
7. Masuda, N., et al. (1999) Nucleic Acids Research 27 (22): 4436–43.
