奧林巴斯高端物鏡系列之3—TIRFM物鏡簡介

全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）是一門非常復雜的光學技術(shù)，目前已經(jīng)被細胞生物學家和神經(jīng)科學家廣泛應用，成為了細胞-基底接觸區(qū)域內(nèi)的豐富的細胞生命活動最強有力的探測方法。如細胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的動力學過程，基底附近的細胞骨架，細胞運動等。

TIRFM技術(shù)依賴于斜射光線在兩種不同折射率光學介質(zhì)表面產(chǎn)生的極淺的消逝波。該效應產(chǎn)生的條件是入射介質(zhì)折射率大于折射介質(zhì)，并且斜射照射到光學界面時入射角大于全反射臨界角。

TIRFM分為棱鏡型和物鏡型。棱鏡型TIRF顯微鏡采用棱鏡產(chǎn)生衰逝波，并用物鏡收集熒光成像。但棱鏡型TIRFM需要在標本上方安裝價格昂貴的棱鏡系統(tǒng)，而且安裝棱鏡還會使透射光觀察技術(shù)受限制，并會造成標本振動。而對物鏡型TIRFM而言，則可以克服以上缺點。物鏡型TIRFM的物鏡既作為收集樣品熒光信號的接受器，同時又作為發(fā)生全反射的光學器件。因此高數(shù)值孔徑的物鏡的使用是物鏡型全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)的關(guān)鍵。

由于細胞的典型折射率為1.33~1.38，因此要實現(xiàn)全內(nèi)反射，在物鏡型全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑（NA）必須大于1.38（NA=nsinθ; nsinθ>nsinθc ；n,θ 分別為物鏡的折射率和孔徑角；θc為發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角）。當物鏡數(shù)值孔徑為1.4時，只有很小的一部分數(shù)值孔徑范圍（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可調(diào)節(jié)范圍（最大孔徑角與全內(nèi)反射角的差值）很小，光束校準比較難，同時光束的強度也很難提高。若使用數(shù)值孔徑為1.65的物鏡，則有一個大的多的孔徑范圍（1.65-1.38=0.27）可以被利用，則入射角可調(diào)節(jié)范圍變大，降低了操作難度。

奧林巴斯提供的TIRFM物鏡，包括了數(shù)值孔徑1.69的最高分辨率的特殊物（APO100XOHR），這意味著TIRFM能夠在小于40納米深度實施觀察。100倍物鏡（UAPON 100xO TIRF）和60倍 物鏡（APON 60xO TIRF），其數(shù)值孔徑更是分別達到了1.65、1.49，其明場熒光顯微鏡的亮度比傳統(tǒng)100Xoil/1.4N.A. 物鏡提高了28%，分辨率也由0.240μm提高到0.203μm，為單分子影像觀察提供更明亮和更佳的對比度。此外150倍的高倍率高數(shù)值孔徑的物鏡(UAPON 150xO TIRF)適用于340nm紫外透射，可應用在紫外激發(fā)熒光染料的TIRFM成像中。

Effect of the Apo100XOHR(N.A.: 1.65):

Single molecule fluorescence image of the Tetramethyl rhodamine