科研中的“新星”技術(shù)——MicroRNA熒光定量PCR

Micro RNA簡介
微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)是生物體內(nèi)源長度約為20－23個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百miRNA。到目前為止，已報道有幾千種miRNA存在于動物、植物、真菌等多細胞真核生物中，進化上高度保守。

Micro RNA產(chǎn)生機理
miRNA 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha處理成70-100 個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運輸?shù)郊毎�質(zhì)，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNA 可以對不完全互補的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，因而每個 miRNA 可以有多個靶基因，而幾個 miRNA可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個 miRNA 來經(jīng)濟地調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個 miRNA 的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。對于基于 miRNA 調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如下圖所示


Micro RNA的特征
已經(jīng)被鑒定的miRNA據(jù)推測大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、約70個堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。
最近3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細胞中鑒定的100個新miRNA中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個堿基的區(qū)別），Lau 和Bartel 實驗室的同事更加認為：所有的miRNA可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。
Bantam 最早被認為是果蠅中參與細胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區(qū)域會導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長，而由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來的大小。但是奇怪的是表達這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進行比較，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得這個區(qū)段很象是一個miRNA的前體。這個結(jié)果經(jīng)過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經(jīng)過一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實驗，證實 bantam miRNA在細胞增殖中的作用。研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個潛在的結(jié)合位點（ hid是果蠅中一個誘導(dǎo)凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。
miRNA的表達方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發(fā)育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r相的表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。

Micro RNA的功能
對microRNA的研究正在不斷增加，原因是科學(xué)家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個miRNA中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達模式具有分化的位相性和時序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNA有可能作為參與調(diào)控基因表達的分子，因而具有重要意義。
第一個被確認的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進而抑制蛋白質(zhì)合成，通過調(diào)控一組關(guān)鍵mRNA的翻譯從而調(diào)控線蟲發(fā)育進程(reviewed in Pasquinelli 2002)。
bantam miRNA是第一個被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNA可能參與在細胞分化和組織發(fā)育過程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如mir-14、mir-23 等。
在植物miRNA的研究中有兩條線索提示miRNA可能參與植物的發(fā)育過程。一是在carpel factory (car) 突變株中3個miRNA的表達水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實驗結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNA加工而造成的。多數(shù)的植物miRNA在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。
對一部分miRNA的研究分析提示：miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發(fā)育(Reinhart 2000)，細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003)和細胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個研究表明，2個miRNA水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關(guān)，提示miRNA和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系(Calin 2002)。
由于miRNA存在的廣泛性和多樣性，提示miRNA可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據(jù)推測miRNA在高級真核生物體內(nèi)對基因表達的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNA可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達調(diào)控方式。
然而，大多數(shù)miRNA的功能仍然是個謎。其機理和功能見下圖



Micro RNA識別方法
多個研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR擴增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數(shù)據(jù)庫查詢進行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。
有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’ 來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNA是否真的表達了。
盡管有數(shù)百個miRNA通過生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來，已經(jīng)鑒別出來的miRNA只不過是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來的miRNA是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設(shè)還有很多miRNA在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠遠不夠。

Micro RNA與干細胞
近年來的研究證明，microRNA在干細胞的自我復(fù)制、定向分化和組織再生中，也起著十分重要的作用。它是干細胞特性、維持、轉(zhuǎn)化功能的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)者，是當(dāng)前干細胞調(diào)節(jié)研究的一個重點。最近，Gangara Ju. VK和Lin H在Nature Stem Cell作了一篇綜述，系統(tǒng)的總結(jié)了microRNA對干細胞調(diào)節(jié)作用。

但是，microRNA對干細胞的調(diào)節(jié)作用還遠遠不止于此。它還參與細胞周期、細胞重建(Reprograming)、多能干細胞生成、信號傳遞、特異分化、Riches、修復(fù)、再生、變異、代謝等所有過程。

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