ELISA試劑盒開發(fā)及使用過程中的常見問題及對策

現(xiàn)象

可能原因

解決方法

板條不顯色或者無相應數(shù)值

試劑使用順序混亂，或操作步驟出錯

嚴格遵循實驗說明重復實驗

使用了不同批次的試劑

確保試劑來自同一試劑盒

板條受潮嚴重

板條要封好，干燥劑失效要及時更換

低

吸

光

度

OD

值

試劑過期，或者不同的批次混用

查證過期試劑和批次

洗液配制錯誤、洗滌浸泡時間過長

按照說明書要求洗滌，并正確配制洗液

孵育時間過短

按照說明書要求，嚴格計算好時間

試劑污染

確保吸取不同液體更換新的槍頭和盛放器皿

試劑溫度過低

根據(jù)試劑體積大小回溫時間相應延長，確保試劑完全回溫

使用錯誤波長讀數(shù)，或者酶

標儀失靈

確保450 nm波長讀數(shù)，檢查酶標儀是否故障

試劑盒處于極端的條件

使用完畢的部分請立即放回冰箱，勿置于過熱環(huán)境時間太長

過高的

背景值或吸光度（OD值）

使用了質量差的水配制試劑

使用雙蒸水或去離子水配制試劑

洗滌不當或者洗板機洗板效果不好

增加1-2次洗滌，每孔至少加入250μL洗液

酶標儀失靈，如OD值讀數(shù)很高而顏色很淺

使用校正微孔板檢查酶標儀，檢查光源

實驗室溫度過高，反應時間過長

測定操作溫度是否合適，時間是否計算正確

試劑混淆，被污染或者配制不當

確保使用正確的試劑，準確配制，避免污染

板內

差異性

大

加入標準品和樣品等的時間不一致

使用多道槍加樣，同種試劑加樣途中不能中斷

多道槍使用不當

校準多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致

洗滌系統(tǒng)出現(xiàn)故障

檢查洗滌系統(tǒng)，保持良好運行

板

間

差

異

性

大

板與板之間孵育時間相差太大

獨立計時，確保一致的孵育時間

板與板之間不一致的洗滌過程

確保相同的洗滌次數(shù)，保證洗滌系統(tǒng)正常運作

使用移液槍不當

檢查移液槍，確保吸取相同液量

試劑和樣品處于不同溫度

確保盒內試劑和樣品液等充分回溫，如果試劑體積較大則需要回溫較長時間。不能用溫水浴回溫樣品

不同批次的試劑混用，或試劑盒過期

試劑不要混用，通常0標準品的OD值小于0.5顯示試劑質量下降

一個或

多個標準品數(shù)據(jù)點超出曲線范圍

標準品添加順序混亂，或者放置于錯誤位置

按照說明要求重復實驗，保證標準品添加正確

標準品被污染或與其他標準品混淆

改用新的標準品，按照由低濃度到高濃度的順序添加標準品

洗滌不一致或者洗滌系統(tǒng)失靈

遵循一如既往的洗滌方式，檢查洗滌系統(tǒng)

加入標準品和試劑的時間不一致

由低到高濃度依次添加標準品，使用多道槍移液

多道槍使用不當

校準多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致