morris水迷宮&八臂迷宮實(shí)驗(yàn)方法策略

本實(shí)驗(yàn)由美國科學(xué)家 Richard GM Morris 于 1981 年建立。最初用于研究腦內(nèi)結(jié)構(gòu)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)節(jié)作用，后來逐步發(fā)展成為目前最為常用的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶的模型。這一實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是，嚙齒類動(dòng)物在水中有強(qiáng)烈的逃避水環(huán)境的動(dòng)機(jī)，并以最快、最直接的途徑逃離水環(huán)境。學(xué)會(huì)逃避水環(huán)境的過程體現(xiàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力；根據(jù)周圍環(huán)境進(jìn)行空間定位，有目的地游往水中安全的地方（平臺(tái)），體現(xiàn)動(dòng)物的空間記憶能力。

 

（一） 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用大鼠或小鼠進(jìn)行。大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備由上海欣軟信息科技有限公司（www.softmaze.com）制造，包括一個(gè)灰色或黑色圓形水池（直徑 160cm，高 55cm；小鼠規(guī)格尺寸減半）、一個(gè)平臺(tái)（直徑 10cm）、一臺(tái)跟蹤攝像機(jī)以及攝像機(jī)相聯(lián)的計(jì)算機(jī)（圖 25-1）。池內(nèi)盛水，深 50cm，水溫為攝氏 22~24℃。平臺(tái)置于水面下 2cm（小鼠為 1cm）。在水中加入奶粉或牛奶將水?dāng)嚋喴悦庾寗?dòng)物看清水下平臺(tái)。攝像機(jī)位于水池中央上方 200cm，可記錄動(dòng)物的位置、游泳距離和時(shí)間（從而可計(jì)算出游泳速度）以及游泳路徑等。房間周圍墻壁上貼上色彩鮮明、形狀不同的圖畫用為迷宮外暗示（extra-maze cues）。

 

（二） 實(shí)驗(yàn)方法 分獲得性訓(xùn)練、探查和對(duì)位訓(xùn)練 3 個(gè)過程。

1．獲得性訓(xùn)練（Acquisition phase）理論上將水池分為 4 個(gè)象限，平臺(tái)置于其中一個(gè)象限區(qū)的中央。

（1） 將動(dòng)物（大鼠或小鼠）頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北四個(gè)起始位置之一。記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間（s）。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個(gè)時(shí)間超過 60s，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺(tái)。讓動(dòng)物在平臺(tái)上停留 10s.

（2） 將動(dòng)物移開、擦干。必要時(shí)將動(dòng)物（尤其是大鼠）放在 150W 的白熾燈下烤 5min，放回籠內(nèi)。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練 4 次，兩次訓(xùn)練之間間隔 15~20min,連續(xù)訓(xùn)練 5d。

2．探查訓(xùn)練(probe trial 1)最后一次獲得性訓(xùn)練結(jié)束后的第二天，將平臺(tái)撤除，開始60s 的探查訓(xùn)練。將動(dòng)物由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限（原先放置平臺(tái)的象限）所花的時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

3．對(duì)位訓(xùn)練（reveral phase）測(cè)定動(dòng)物的工作記憶（working memory）。探查訓(xùn)練結(jié)束后的第二天，開始維持 4 天的對(duì)位訓(xùn)練。將平臺(tái)放在原先平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限，方法與獲得性訓(xùn)練相同。每天訓(xùn)練 4 次。每次記錄找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳距離以及游泳速度。4．對(duì)位探查訓(xùn)練（probe trial 2）最后一次對(duì)位訓(xùn)練的第二天進(jìn)行。方法與上述探查訓(xùn)練類似。記錄動(dòng)物 60s 內(nèi)動(dòng)物在目標(biāo)象限（平臺(tái)第二次所在區(qū)）所花時(shí)間和進(jìn)入該區(qū)的次數(shù)。

 

（三） 注意事項(xiàng)

1．對(duì)比食物驅(qū)動(dòng)的模型（如放射臂迷宮），水迷宮實(shí)驗(yàn)的最大優(yōu)點(diǎn)在于，動(dòng)物具有更大的、逃離水環(huán)境的動(dòng)機(jī)。而且不必禁食，特別適合老年動(dòng)物的測(cè)試。加上它對(duì)衰老引起的記憶減弱尤其敏感，因此，水迷宮最常用于老年動(dòng)物記憶的研究。

2．如用小鼠，除游泳池尺寸約為大鼠的 50%以外，平臺(tái)直徑也較少（7.5cm）。實(shí)驗(yàn)方法與大鼠類似，但訓(xùn)練周期較短。一般獲得性訓(xùn)練 3 天共訓(xùn) 16 次（第一天 4 次，后兩天每天 6次；兩次訓(xùn)練之間的間隔 5~10min，第四天為探查訓(xùn)練，第五、六天為對(duì)位訓(xùn)練，每天訓(xùn)練六次，第七天為第二次探查訓(xùn)練。

3.如用肉眼觀察，在所有試驗(yàn)過程中試驗(yàn)著始終坐在同一位置，距離泳池最近的邊緣約60cm。

4．每天在固定時(shí)間測(cè)試。操作輕柔，避免不必要的應(yīng)激刺激。

5．當(dāng)與其他同類實(shí)驗(yàn)相比較時(shí)，要注意到動(dòng)物的性別、品系、泳池的尺寸和水溫等多種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。此外，當(dāng)以游泳速度作為觀察指標(biāo)時(shí)，要考慮到動(dòng)物的體重、年齡以及骨骼肌發(fā)育狀況等對(duì)游泳速度可能造成影響。

6．用老年動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)確認(rèn)動(dòng)物的游泳能力和視力不因年齡增大而影響行為操作。其方法如下：將平臺(tái)露出水面以使動(dòng)物能夠看見平臺(tái)。動(dòng)物放入泳池后如毫無困難地直接游向平臺(tái)，說明動(dòng)物的游泳能力和視力均正常，可以開始實(shí)驗(yàn)。

7．游泳對(duì)動(dòng)物是一個(gè)較大的應(yīng)激刺激，可引起神經(jīng)內(nèi)分泌的變化。這些變化可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。對(duì)老年動(dòng)物，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)心血管疾病而導(dǎo)致卒中甚至死亡。因此，必要時(shí)可將動(dòng)物多次放入泳池或適當(dāng)延長其游泳時(shí)間以增加動(dòng)物對(duì)游泳的適應(yīng)能力。

8．當(dāng)用牛奶或奶粉攪渾泳池的水時(shí)，要定期換水以免水腐敗變質(zhì)；如用白漆達(dá)到同樣目的時(shí)，必須確保白漆對(duì)動(dòng)物沒有毒性。

 

二、放射臂迷宮(八臂迷宮)

八臂迷宮（放射臂迷宮（radial arm maze））實(shí)驗(yàn)也是最為常用的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的模型之一，由 Olton 等人于 20 世紀(jì) 70 年代中期建立。其基本依據(jù)是，控制進(jìn)食的動(dòng)物受食物的驅(qū)使對(duì)迷宮各臂進(jìn)行探究；經(jīng)過一定時(shí)間的訓(xùn)練，動(dòng)物可記住食物在迷宮中的空間位置。該方法可同時(shí)測(cè)定動(dòng)物的工作記憶（working memory）和參考記憶（reference memory）。所用動(dòng)物包括大鼠、小鼠和鴿子。這一模型對(duì)腦區(qū)毀損和多種藥物均很敏感。后者包括乙醇、東###（抗膽堿能藥）和 MK-801(NMDA 受體拮抗劑)等。

 

（一） 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)多數(shù)采用八臂放射迷宮，也有采用 十二臂或者二十四臂迷宮。這里介紹上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)的八臂迷宮。每個(gè)臂長 41.9cm，寬11.4cm，高 10.1cm；其上有一透明蓋，兩側(cè)各有兩個(gè)相對(duì)的光電管。迷宮中央八角形區(qū)的直徑為 27.4cm；上有一透明頂蓋。中央?yún)^(qū)通往各臂的入口處有一活動(dòng)門，用來對(duì)動(dòng)物的出入臂進(jìn)行控制。迷宮與計(jì)算機(jī)相聯(lián)。也可用攝像跟蹤系統(tǒng)（video tracking system）取代光電管來記錄動(dòng)物在迷宮內(nèi)的活動(dòng)行為。放置迷宮的房間內(nèi)有一些外部暗示（extramaze cues）。動(dòng)物在迷宮內(nèi)可以看見這些暗示，并借此進(jìn)行空間定位。實(shí)驗(yàn)用大鼠或小鼠進(jìn)行。

 

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1．動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境 1 周后，稱重，禁食 24 小時(shí)。此后每天訓(xùn)練結(jié)束后限制性地給予正常食料（據(jù)體重同，大鼠 16-20g，小鼠 2-3g），以使體重保持在正常進(jìn)食大鼠的 80%~85%。

2．第二天，迷宮各臂及中央?yún)^(qū)分撒著食物顆粒（每只 4~5 粒，直徑約 3~4mm）。然后，同時(shí)將 4 只動(dòng)物置于迷宮中央（通往各臂的門打開）。讓其自由攝食、探究 10min。

3．第三天，重復(fù)第二天的訓(xùn)練。這一過程讓動(dòng)物在沒有很強(qiáng)的應(yīng)激條件下熟悉迷宮環(huán)境。

4．第四天起，動(dòng)物單個(gè)進(jìn)行訓(xùn)練：在每個(gè)臂靠近外端食盒處各放一顆食粒，讓動(dòng)物自由攝食。食粒吃完或 10min 后將動(dòng)物取出。

5．第五天，將食物放在食盒內(nèi)，重復(fù)前一天的訓(xùn)練，一天 2 次。

6．第六天以后，隨機(jī)選 4 個(gè)臂，每個(gè)臂放一顆食粒；各臂門關(guān)閉，將動(dòng)物放在迷宮中央；30s 后，臂門打開，讓動(dòng)物在迷宮中自由活動(dòng)并攝取食粒，直到動(dòng)物吃完所有 4 個(gè)臂的食粒。如經(jīng) 10min 食粒仍未吃完，則實(shí)驗(yàn)終止。每天訓(xùn)練兩次，其間間隔 1h 以上。

記錄以下 4 個(gè)指標(biāo)：1工作記憶錯(cuò)誤（working memory errors）,即在同一次訓(xùn)練中動(dòng)物再次進(jìn)入已經(jīng)吃過食粒的臂；2參考記憶錯(cuò)誤（reference memory errors ），即動(dòng)物進(jìn)入不曾放過食粒的臂； 總的入臂次數(shù)； 測(cè)試時(shí)間，即動(dòng)物吃完所有食粒所花的時(shí)間。此外，計(jì)算機(jī)還可記錄動(dòng)物在放射臂內(nèi)及中央?yún)^(qū)的活動(dòng)情況，包括運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間等。連續(xù) 5次訓(xùn)練的工作記憶錯(cuò)誤為零、參考記憶錯(cuò)誤不超過 1 次時(shí)，可以開始藥物測(cè)試或腦內(nèi)核團(tuán)結(jié)構(gòu)毀損實(shí)驗(yàn)。一般先給溶劑（如生理鹽水），再給削弱記憶的藥物（如東MK-801 等），然后加用增強(qiáng)記憶的藥物，劑量由低到高。

 

(三） 計(jì)算與數(shù)據(jù)分析

用兩個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)動(dòng)物的記憶，即工作記憶錯(cuò)誤頻率（frequency of working memory errors） 和參考記憶錯(cuò)誤頻率（frequency of reference memory errors） ,分別等于工作記憶錯(cuò)誤或參考記憶錯(cuò)誤與總的入臂次數(shù)的比率。用這兩個(gè)指標(biāo)分別評(píng)價(jià)工作記憶與參考記憶。同時(shí)，計(jì)算平均探究時(shí)間（average exploration time）,即測(cè)試時(shí)間與總的入臂次數(shù)之比，為評(píng)價(jià)一般運(yùn)動(dòng)活性的指標(biāo)。根據(jù)毀損的腦區(qū)結(jié)構(gòu)或所給削弱記憶的藥物的不同，工作記憶錯(cuò)誤頻率和/或參考記憶錯(cuò)誤頻率顯著增高，記憶增強(qiáng)藥物或治療可使這種錯(cuò)誤頻率降低。

 

（四） 注意事項(xiàng)

1． 小鼠放射迷宮設(shè)備和實(shí)驗(yàn)程序與大鼠類似，但迷宮規(guī)格應(yīng)比大鼠迷宮小 1/4~1/2，以免增加小鼠行為操作難度。

2． 本實(shí)驗(yàn)也可只用來測(cè)定工作記憶。方法中唯一不同的是，在所有放射臂均放置食粒，而不是只選 4 個(gè)臂放置食粒。

3． 慢性應(yīng)激對(duì)動(dòng)物的迷宮操作可產(chǎn)生影響，且存在性別差異。經(jīng)過慢性應(yīng)激以后，雄性大鼠記憶力減弱，表現(xiàn)為記憶錯(cuò)誤頻率增加；雄性大鼠的空間記憶反而增強(qiáng)，表現(xiàn)為錯(cuò)誤頻率減少。

4． 即使在限制進(jìn)食條件下，也應(yīng)讓大鼠體重每周增加 5g，以免動(dòng)物因營養(yǎng)不良而患病。剔除身體狀態(tài)不良的動(dòng)物。

5． 迷宮周圍的任何一件物品均可被動(dòng)物用來作為空間定為的標(biāo)志。去除或移動(dòng)這些標(biāo)志可能使動(dòng)物操作困難并降低迷宮臂選擇的準(zhǔn)確性。

6． 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌�迷宮放射臂的數(shù)目可不同，包括 8、16、24、32、40 和 48 臂迷宮。迷宮臂越少要求動(dòng)物記住探究過的臂也越小，動(dòng)物的行為操作就越簡單。增加臂的數(shù)目一方面增加了對(duì)動(dòng)物空間記憶的要求，另一方面也引入了更多的、有必要考慮的干擾因素（例如過去的迷宮學(xué)習(xí)對(duì)目前所測(cè)記憶的影響）。所以，通常使用 8 臂放射迷宮，既可減少不必要的、過多臂的干擾，又可縮短訓(xùn)練和測(cè)試所花的時(shí)間。

7． 所用食物通常為小塊的、帶巧克力味（動(dòng)物最喜歡的味道之一）或甜味的早餐圈（每塊 10mg）；也可用液體食物（如巧克力奶或水）。后者對(duì)于測(cè)試某些影響動(dòng)物對(duì)固體食物吞咽的藥物（如東###）尤為實(shí)用。

8． 影響動(dòng)物迷宮操作主要有兩大因素：對(duì)迷宮或觀察者的恐懼與動(dòng)物探究習(xí)性和已知放在迷宮臂內(nèi)食物的驅(qū)使�？謶忠蛩剡^強(qiáng)會(huì)阻止動(dòng)物的迷宮操作，使動(dòng)物始終停留在迷宮的某一個(gè)地方而不去探究。缺乏對(duì)食物的渴求也會(huì)產(chǎn)生類似結(jié)果，增加對(duì)動(dòng)物的撫摸，必要時(shí)加高迷宮臂的側(cè)墻，有助于減少動(dòng)物的恐懼。如食物的驅(qū)使作用不足，可減少食物量，但必須同時(shí)監(jiān)測(cè)體重和一般身體狀況。通常大鼠體重不應(yīng)低于禁食前的80%；對(duì)多數(shù)大鼠，體重降低 15%即可。

9． 與水迷宮不同，放射臂迷宮適合反復(fù)測(cè)試或長期記憶的測(cè)試。一般認(rèn)為，工作記憶代表短期記憶，參考記憶代表長期記憶。