鑒別科研類ELISA試劑盒檢測(cè)樣本適合種類的方法

對(duì)于ELISA客戶來說，在實(shí)驗(yàn)中可能用到不同的樣本，如何辨別所購(gòu)的試劑盒能否測(cè)手中的樣本呢？

對(duì)于最常見的細(xì)胞上清，我們大家知道，培養(yǎng)細(xì)胞過程中，無特別情況一般是10%的牛血清加入培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)后，細(xì)胞的吸收消耗，最后細(xì)胞上清中蛋白含量會(huì)很少，而且對(duì)于一般牛血清生產(chǎn)的廠家來說，在生產(chǎn)過程中已經(jīng)去除了大部分對(duì)檢測(cè)有干擾的物質(zhì)，所以對(duì)一般ELISA而言，不會(huì)影響抗體抗原的結(jié)合。

那么比較常見的血清血漿樣本呢？

血清是最常用的ELISA標(biāo)本之一，ELISA檢測(cè)中血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本中干擾性物質(zhì)是引起檢測(cè)后結(jié)果偏高或偏低的主要原因，干擾性物質(zhì)分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩大類：

1．內(nèi)源性物質(zhì)
   常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。
（1）類風(fēng)濕因子 ：血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子（RF）在ELISA檢測(cè)中，可與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)OD值偏高。

（2）補(bǔ)體 ： ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成檢測(cè)OD值偏高。
（3）嗜異性抗體 
     人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物（如鼠等）Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成檢測(cè)OD值偏高。

此外血清中嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)及血清中脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。

2．外源性物質(zhì) 
       外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過久、標(biāo)本凝集 不全和采血管中添加物等影響。
（1）標(biāo)本溶血 
    由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測(cè)定結(jié)果。

（2）標(biāo)本受細(xì)菌污染 ：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。 
（3）標(biāo)本保存不當(dāng) ：在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至造成檢測(cè)OD值偏高；

（4）標(biāo)本凝集不全

綜上所述，在ELISA檢測(cè)中影響血清血漿樣本的因素很多，在考慮試劑因素和操作因素之外，也應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析。

血清和血漿樣本

目前科研類ELISA試劑盒生產(chǎn)廠家聲稱各種標(biāo)本都能檢測(cè)，但使用后我們發(fā)現(xiàn)有些試劑盒對(duì)血清和血漿樣本的檢測(cè)效果不好，表現(xiàn)在光值偏低，如RF因子存在的話，光值偏高。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的主要原因是雜蛋白較多，成份復(fù)雜。所以需要特別的試劑才能消除影響。

如何分辨所購(gòu)試劑盒是否能測(cè)血清血漿樣本呢?

這要分幾種情況：

1、如廠家沒有提供專門用于血清血漿樣本的緩沖液，那么只要用已知濃度的待測(cè)指標(biāo)蛋白加入所測(cè)種屬的血清作為樣本加樣和用已知濃度的待測(cè)指標(biāo)蛋白加入PBS緩沖液中同時(shí)檢測(cè)對(duì)比，即可知道該試劑盒是否可以直接用來測(cè)血清血漿樣本。

2、如廠家沒有提供專門用于血清血漿樣本的緩沖液，只是有一個(gè)籠統(tǒng)的或統(tǒng)一的稀釋液，那么只要用已知濃度的待測(cè)指標(biāo)蛋白加入所測(cè)種屬的血清直接加樣和用已知濃度的待測(cè)指標(biāo)蛋白加入廠家提供的統(tǒng)一的緩沖液中同時(shí)檢測(cè)，也可得出該試劑盒是否可直接用來檢測(cè)血清血漿樣本。

3、如廠家提供專門用于血清血漿樣本的緩沖液，可用已知濃度的待測(cè)指標(biāo)蛋白加入所測(cè)種屬的血清直接加樣和用緩沖液按說明書分別加樣，也可得出結(jié)果。

如該種類型試劑盒樣本總量如為100μl的話，一般而言，會(huì)是50μl的樣本加樣量和50μl的特定的緩沖液。

在使用試劑盒的過程，可將已知濃度的蛋白用血清或血漿調(diào)配到試劑盒標(biāo)定的檢測(cè)限的最高值的2倍，加入50μl做兩孔，一孔補(bǔ)入常規(guī)的50μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，一孔補(bǔ)入50μl樣本分析緩沖液，即可區(qū)分出效果來，有時(shí)候，有些廠家為了達(dá)到“消除”的效果，在樣本分析緩沖液中加入待測(cè)目標(biāo)蛋白，為了鑒別出這種情況，也可直接加入樣本分析緩沖液做一孔，同時(shí)做對(duì)比，這樣可試出試劑盒中的針對(duì)血清血漿樣本的緩沖液是否真的有效。