支氣管哮喘小鼠氣道反應(yīng)性無創(chuàng)檢測方法的建立

支氣管哮喘小鼠氣道反應(yīng)性無創(chuàng)檢測方法的建立.doc

李斌愷 　 賴克方 　 洪燕華 　 王法霞 　 陳如沖 　 林少建 　 鐘南山

【摘要】 　 目的 　 目前國內(nèi)對支氣管哮喘 (簡稱哮喘) 小鼠的評價多數(shù)僅立足于氣道炎性指標 ,不能完全反映哮喘的病理生理特征 。 本所率先從國外引進了小動物無創(chuàng)檢測和有創(chuàng)檢測肺功能儀 。 無創(chuàng)法檢測時小鼠不必麻醉 ,而且每次可以同時檢測多只小鼠 ,具有較大的優(yōu)越性 ,但能否取代有創(chuàng)法尚需更多的數(shù)據(jù) 。本研究旨在建立無創(chuàng)檢測小鼠氣道高反應(yīng)性的檢測方法 ,并與有創(chuàng)檢測方法進行比較 。 方法 　 根據(jù)動物模型和氣道反應(yīng)性檢測方法不同 ,動物分為 : ① 無創(chuàng)哮喘組 ; ② 無創(chuàng)對照組 ; ③ 有創(chuàng)哮喘組 ; ④ 有創(chuàng)對照組 。 采用卵白蛋白致敏和激發(fā) ,建立 BALB/ c 小鼠哮喘模型 ,生理鹽水作為對照 ,分別用無創(chuàng)和有創(chuàng)的方法測定氣道反應(yīng)性 。 哮喘動物霧化吸入0 . 2～50 g/ L 倍增濃度的乙酰甲膽堿 ( Mch) ,測定相應(yīng)濃度下的增強呼氣間歇 ( Pe nh) 值或氣道阻力 ( RL ) 值等指標 。 將小鼠吸入 Mc h 后 RL 或 Penh 增加 2 倍的激發(fā)濃度以 PC100 來表示 。 所有動物都行支氣管肺泡灌洗 , 收集灌洗液 , 涂片染色后分類計數(shù) 。結(jié)果 　 無創(chuàng)哮喘組 PC100 均 ≤6 . 25 g/ L ,對照組 PC100 均 ≥ 12 . 5 g/ L 。 其 Lo g2 ( 10 PC100 ) 值 ( 5 . 36 ± 0 . 84) 顯著低于對照組 ( 7 . 97 ± 0 . 82)( P < 0 . 01) 。 無創(chuàng)哮喘組從 Mc h 濃度3 . 12 g/ L 開始 , 其 Pe nh 值明顯高于對照組 。有創(chuàng)哮喘組 RL 值從Mc h 濃度0 . 39 g/ L開始就明顯高于相應(yīng)對照組 ( P < 0 . 05) 。 無創(chuàng)組與有創(chuàng)組的氣道反應(yīng)性相關(guān)系數(shù) R =0 . 96 ( P < 0 . 01) 。 無創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)哮喘組的嗜酸粒細胞分別為 ( 54 . 00 ± 5 . 96) % , ( 55 . 93 ± 5 . 92) % ,顯著高于各自對照組的 ( 0 . 38 ± 0 . 52) % , ( 0 . 63 ± 0 . 74) %( P < 0 . 01) 。 結(jié)論 　 本研究表明以 Penh 為主要測定指標的無創(chuàng)方法 ,可以成功檢測哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性 。

【關(guān)鍵詞】 　 小鼠 ;氣道反應(yīng)性 ; 支氣管哮喘 ;增強呼氣間歇 ; 無創(chuàng)檢測

【Ab st ra ct】 　 Objective 　Most of t he evaluation on asthmatic  mouse model only based on the airway inflammation , not fully reflecting its pathophysiology. Noninvasive method of measuring bronchial hyper responsiveness can detect several conscious mice in one time , but whether it can replace the invasive technique needs more data to be identified. This study aims to establish a non-invasive detection of mouse airway hyper responsiveness ,comparing with the invasive method. Methods 　 According to different ways of detection , mice were divided into four groups : non-invasive asthma group , non-invasive control group ,invasive asthma group and invasive control group . Mouse was sensitized and challenged with ovalbumin ( OVA) for asthmatic model . The mice were challenged with increasing concentrations of methacholine aero sol from 0 . 2 250 g/ L ,and the airway resistance was measured. Enhance pause ( Penh) or airway resistance ( RL ) was taken for each group . The dose of methacholine causing 100 % increase of respiratory resistance was defined as PC100 . The PC100 values were converted into Log2 ( 10 PC100 ) for statistical analysis. Bro nchoalveolar lavage cytology was performed to evaluate the airway inflammation. Results 　The PC100 of non-invasive asthma group was ≤6 . 25 g/ L , and the non-invasive control group’s ≥12 . 5 g/ L . I t s Lo g2 ( 10 PC100 ) value was significantly less than that of control group , ( 5 . 36 ± 0 . 84) vs ( 7 . 97 ± 0 . 82) ( P < 0 . 01) . The Penh value of non -invasive asthma group began significantly increasing when the concentration of Mch was 3 . 12 g/ L . The RL value of invasive asthma group was increasing at the beginning of 0 . 39 g/ L ( P < 0 . 05) . The coefficient rate of two groups was 0 . 96 ( P < 0 . 01 ) . The EOS ( %) of non-invasive asthma group or invasive asthma group was 54 . 00 ± 5 . 96 , 55 . 93 ± 5 . 92 respectively , significantly larger than that of control group ( 0 . 38 ±0 . 52 ,0 . 63 ± 0 . 74 , P < 0 . 01) . Conclusions 　This study shows that single-chambered barometric whole-body plethysmography as a non- invasive lung function test can success fully detect airway responsiveness in asthmatic mouse model .

【Key words 】　Mice ; Airway hyper responsiveness ; Bronchial asthma ; Enhance pause ; Noninvasive method

從最早的電刺激離體氣管平滑肌收縮能力測定 ,到現(xiàn)在的無創(chuàng)單腔整體體積描計,國外在對動物氣道反應(yīng)性的測定技術(shù)上經(jīng)過了漫長的發(fā)展歷程 。 而目前國內(nèi)在對支氣管哮喘 ( 簡稱哮喘) 小鼠的評價上多數(shù)僅僅立足于氣道炎性指標 ,在氣道反應(yīng)性的檢測方面近幾年才起步 ,而且是用有創(chuàng)的方法。我所率先從國外引進了動物無創(chuàng)檢測的肺功能儀 。氣管插管后再測定動物氣道阻力的有創(chuàng)法是評價動物氣道反應(yīng)性的經(jīng)典方法 。 無創(chuàng)法則不需氣管插管等繁瑣的步驟 ,在動物處于自然狀態(tài)下就可以直接測定其氣道反應(yīng)性 ,而且每次可以同時檢測多只小鼠 ,具有較大的優(yōu)越性 ,但能否取代有創(chuàng)法尚需更多的數(shù)據(jù) 。 因此 ,我們有必要探討其與有創(chuàng)法的相關(guān)性 ,判定其是否能夠有效檢測動物的氣道反應(yīng)性 ,以期建立哮喘小鼠氣道反應(yīng)性的無創(chuàng)檢測方法 。

材 料 與 方 法

一 、 儀器與試劑

儀器 : 本實驗采用美國 B u xco 公司小鼠無創(chuàng)肺功能儀和有創(chuàng)肺功能儀 , 是目前國際上通用的小鼠肺功能檢測儀器 ,主要包括體描箱 ,壓力傳感器 ( 流量傳感器) ,信號放大器和霧化器等 。 其工作原理是 ,將乙酰甲膽堿 ( met hac holi ne , Mc h) 或生理鹽水 ( N S) 等通過霧化器霧化入體描箱內(nèi) ,箱內(nèi)小鼠吸入霧化氣體后呼吸運動的改變引起箱內(nèi)壓力 、 流量產(chǎn)出相應(yīng)的變化 ,連接于體描箱的壓力傳感器 ( 流量傳感器) 將采集到的信號傳至信號處理系統(tǒng) ,并在信號放大器作用下轉(zhuǎn)化為呼吸動力學(xué)各指標值 。 兩套肺功能儀中 ,無創(chuàng)肺功能儀具有 6 個體描箱 ( 也有配置更多的) ,相應(yīng)的傳感器可以將各個箱內(nèi)壓力 、 流量的變化同步傳至信號處理系統(tǒng)處理 ,因此可以同步為多只小鼠進行肺功能檢測 。 主要試劑 : 雞卵白蛋白 ( OVA ) ( Ⅴ 級 , 美國 S i gma 公司) , 氫氧化鋁凝膠 ( 美國 S i g ma 公司) , Mc h ( 美國 Si gma 公司) 。

二 、 實驗動物及分組

實驗動物 : SP F 級 BALB/ c 雌鼠 ,5～6 周齡 ,體質(zhì)量 18～20 g ,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 ,并在該中心飼養(yǎng) 。 飼料為去 OVA ( 不含雞蛋) 的特殊食物 。 飼養(yǎng)環(huán)境符合 SP F 實驗動物級環(huán)境設(shè)施標準 。分組 : 根據(jù)動物模型和氣道反應(yīng)性檢測方法不同 ,分為 : ① 無創(chuàng)哮喘組 ; ② 無創(chuàng)對照組 ; ③ 有創(chuàng)哮喘組 ; ④ 有創(chuàng)對照組 。 其中 ,無創(chuàng)哮喘組 、 有創(chuàng)哮喘組每組 10 只小鼠 ; 無創(chuàng)對照組 、 有創(chuàng)對照組每組 8 只小鼠 。

三 、 哮喘模型的建立方法

實驗第 0 天 、 第 7 天和第 14 天行腹腔注射致敏 :模型組每次給予 20μ g OV A + 150μ l Al (O H) 3 + 50 μ l N S( 100 mg/ L ) 混懸液 ; 對照組給予 200 μ l N S 。 實驗第 28 天 、 第 29 天和第 30 天行滴鼻激發(fā) ; 模型組每次給予50 μ l OV A2 N S ( 2 g/ L ) 滴鼻 ,對照組給予 50 μ l N S 。

四 、 檢測的指標及原理

無創(chuàng)組用體積描記法測定增強呼氣間歇 ( e n ha nce d p a u se , Pe n h) 如圖 1[ 1 ]所示 : 曲線反映的是體描箱內(nèi)小鼠呼吸時的壓力變化 ; 曲線上部分為呼氣相 ,下部分為吸氣相 ; 氣流受限時 , 曲線的呼氣相部分明顯延長 ,呈現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙時特有的呼氣末凹陷 ,呼氣相延長的程度反映了氣流受限的程度 ,定義為呼氣間歇( Pa u se) ,用吸氣峰流速 (p ea k i n spi r a t io n p re s s ur e , P I P) 及呼氣峰流速 ( p ea k e xpi r at io n p r e s s ur e , P EP) 比將其標準化即得 Pe n h ,此參數(shù)即可反映氣道反應(yīng)性 。 計算公式如圖所示 : 其中 Te 代表呼氣相時間 , Ti 代表吸氣相時間 , T r 代表呼氣相 “ 松弛時間” 即呼氣相描記箱內(nèi)壓力衰減為 P EP 的 36 %所用時間。Penh = P EP/ PIP ×Pa u se 。 有創(chuàng)組測定的是氣道阻力 ( RL ) 值 。