hERG 鉀離子通道高通量安全性篩選-Molecular Devices IonWorks Barracuda
hERG 鉀離子通道高通量安全性篩選
——IonWorks Barracuda高通量全自動膜片鉗系統(tǒng)多次加樣檢測方法的優(yōu)勢
特點：
• 超高通量——可以滿足大批量化合物篩選的需求
• 每小時> 6,000數(shù)據(jù)點
• 384通道同時記錄
• 超低的運行成本
• 穩(wěn)定、可靠的設(shè)備
• 低廉、高效的耗材
• 每孔連續(xù)加樣方法記錄得到的濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果類似于傳統(tǒng)手動膜片鉗記錄結(jié)果
• 高一致性、可重復的數(shù)據(jù),
• 專利的Population Patch Clamp 技術(shù)保證了高度可重復性記錄
由于hERG (人 ether-à-go-go基因)被抑制后潛在的致死風險，愈發(fā)凸顯了在藥物研發(fā)早期階段開展候選藥物hERG安全性篩選的重要性。因其運行高成本、低通量及對操作人員的高要求，作為研究離子通道活性的和藥理學特性金標準的傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)對于大批量的篩選需求來說明顯不切實際。即使經(jīng)過過去十多年全自動膜片鉗系統(tǒng)的快速發(fā)展，高成本和通量相對較低的因素任然限制了hERG離子通道的安全性篩選。
IonWorks Barracuda® 全自動膜片鉗系統(tǒng)為制藥和生物技術(shù)企業(yè)提供了真正的解決方案，低成本、快速、高效地對數(shù)以千計的化合物進行hERG離子通道安全性篩選。384道平行記錄的性能以及低廉的耗材使得IonWorks Barracuda成為中、高通量大批量化合物篩選的理想設(shè)備。
每孔多次加樣的方法帶來的特點之一是所記錄的量效數(shù)據(jù)類似于傳統(tǒng)手動膜片鉗記錄的數(shù)據(jù)，這樣所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量更可靠。這種方法可廣泛用于多種離子通道的研究中，特別是觀察電壓門控離子通道的化合物阻斷效應(yīng)的研究。
研究目的
采用每孔多次加樣的方法可以增加通量并節(jié)省化合物篩選成本。本研究旨在評估在IonWorks Barracuda系統(tǒng)中進行hERG化合物安全性篩選中使用加樣方法的效果，并與Barracuda中另一種整板每孔單點加樣的方法進行比較。
IonWorks Barracuda系統(tǒng)支持每個刺激方案下最多８次加樣，且一次實驗中刺激方案的次數(shù)不限，從而在實際上來說每次實驗的加樣次數(shù)是沒有限制的。
檢測化合物濃度效應(yīng)的藥理學特性時，在整個384孔記錄板的每一個記錄孔中可以采用從低濃度至高濃度的多次累積加樣方法。這種單孔重復多次加樣的方法有一下幾方面優(yōu)勢：
• 增加通量
• 降低成本
• 與傳統(tǒng)檢測化合物作用于離子通道效應(yīng)的方法一致，每個細胞或記錄位點加入化合物的多個濃度并檢測其連續(xù)的梯度濃度效應(yīng)。
典型的單孔８次加樣實驗需要大約30分鐘，產(chǎn)生>3000數(shù)據(jù)點，從而每小時可以得到>6000個數(shù)據(jù)點。
IonWorks Barracuda系統(tǒng)篩選hERG安全性化合物時也可以采用另外一種整板加樣且每孔只加樣一次的方式。
在此方法下，大約每20分鐘 完成一次384個數(shù)據(jù)點的采集，從而每小時可以得到>1100個數(shù)據(jù)點。
為了有效的比較上述兩種加樣方法的藥理學數(shù)據(jù)，本次實驗使用了完全一致的hERG 陽性抑制劑，并采用６個濃度梯度進行檢測。
結(jié)果
比較化合物多濃度效應(yīng)的藥理學特性時，單孔多次加樣方法比整板單次加樣增加了超過４倍的通量。
７個hERG通道的陽性抑制劑在每個記錄孔中連續(xù)添加６個梯度濃度。兩種加樣方法結(jié)果（單次加樣和多次加樣）的比較見表１。通量每次實驗增加至2300個數(shù)據(jù)點，每小時為4600個數(shù)據(jù)點。
材料和方法
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人Kv11.1 通道的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)來自ChanTest 公司(Cleveland, OH)。本實驗中所使用的所有試劑和藥品均來自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO).
hERG 離子通道多次加樣方法的開發(fā)
多次加樣的方法中細胞需要進行多次的溶液交換并且電壓刺激時間延長，從而增加了電流rundown 的可能性。為提高試驗時間加長后細胞記錄的穩(wěn)定性，使用單次脈沖電壓刺激方案代替原來單次加樣方法中的５次脈沖電壓刺激方案。化合物溶于細胞外液中，濃度為3 倍終濃度，含有1% DMSO。
實驗時加入記錄孔后被稀釋至最終濃度，DMSO 的濃度為0.33% �；衔锛尤胗涗浛缀蠓跤环昼姾箝_始給予電壓刺激，+40 mV 持續(xù)一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以檢測尾電流峰值（圖1）。一次實驗需要準備6 個不同濃度梯度的化合物板，便于加樣頭完成6 次加樣。完整的實驗方法確認后，依次檢測選定的7 個hERG 陽性藥物。
多次加樣實驗的記錄穩(wěn)定性結(jié)果見圖2。圖中分別展示了其中一次實驗所有384 孔的平均封接電阻值，以及24 個
對照孔0.33% DMSO 外液6 次加樣后得到的尾電流峰值為基準的平均通道激活程度。
單孔多次加樣方法的藥理學特性：產(chǎn)生的累積濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)類似于傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)方法
在7 個hERG 陽性藥物藥理學驗證實驗中，每次實驗需要連續(xù)監(jiān)測6 塊化合物板。每個化合物板只有每個待檢
測化合物的一個濃度，每個化合物重復24 個孔。第一塊化合物板的濃度最低，第六塊化合物板的濃度最高。
在7 次獨立的實驗中各自得到一個量效曲線和相應(yīng)的IC50 值。圖3 展示了一個代表性實驗中得到的藥學曲線。
化合物多次添加方法的數(shù)據(jù)重復性檢測
篩選實驗中數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性是非常重要的。采用前述已優(yōu)化好的實驗條件，所有七次陽性hERG 抑制劑的藥理學數(shù)據(jù)均表現(xiàn)出良好的可重復性。六次化合物添加實驗的穩(wěn)定性展現(xiàn)在圖4 中。這種穩(wěn)定性尤其重要，體現(xiàn)在加樣后及施加電壓刺激后的穩(wěn)定電流記錄的技術(shù)要求方面。
其中一個檢測的陽性藥物，哌咪清（Pimozide） ，觀察到其重復性低于預(yù)期。這可能與化合物的高親脂性相關(guān)，從而造成了化合物在篩選過程中多數(shù)的塑料材料環(huán)境下的不穩(wěn)定性。
總結(jié)
本次實驗驗證了單孔多次加樣方法在保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的前提下，可以顯著增加通量且降低運行成本。
• 通量顯著的從 1100增加至4600個數(shù)據(jù)點每小時。
• 藥理學結(jié)果方面，單次加樣和多次加樣的IC50值保持很好一致性。
• 整個實驗結(jié)果保持穩(wěn)定性和重現(xiàn)性
• 累積濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)類似于傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)方法
參考文獻
Application protocol: “Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay”, by Karen Cook, M.S., James L. Costantin, Ph.D., and Xin Jiang, Ph.D.,Molecular Devices, LLC (2011)
