誘導多能干細胞毒性實驗介紹-Molecular Devices SpectraMax I3

優(yōu)勢：
1.  簡易、快速的通過檢測細胞貼壁面積進行96或384孔板細胞毒性篩選
2.  按照一般微孔讀板機的簡單流程
3.  具有細胞影像數(shù)據(jù)，增加數(shù)據(jù)可信性

藥物引起的組織毒性是候選藥物未能進入市場的一個重要原因，因此，安全性和有效性試驗的高度預(yù)測分析是提高藥物開發(fā)和降低候選藥物抗藥性的關(guān)鍵。人源誘導多能干細胞(iPSC)衍生的肝細胞和神經(jīng)元，表現(xiàn)出成體細胞的典型特征和新陳代謝機制，是作為早期藥物開發(fā)過程中高內(nèi)涵篩選的理想選擇。
雖然使用熒光和化學發(fā)光讀板機檢測標準細胞毒性實驗已經(jīng)眾所周知，但是，如果使用細胞成像計數(shù)儀進行實際細胞觀察會獲得更多有用信息。

通過標準存活力實驗獲得更多信息

細胞存活力染料，如Calcein AM，可以用來檢測總化合物在活細胞中的毒性。Calcein AM只在表現(xiàn)出酯酶活性的活細胞內(nèi)才會發(fā)出綠色熒光。iPSC來源的人肝細胞，首先加入不同化合物處理24小時，然后用Calcein AM染色；活細胞圖像使用SpectraMax® MiniMax™ Imaging Cytometer獲取(SpectraMax® i3多功能檢測平臺
的升級選項)�；罴毎麅�(nèi)的綠色胞漿區(qū)域使用SoftMax® Pro軟件內(nèi)的細胞增殖分析模塊進行鑒定(Figures 1 和 2)， IC50值測定使用軟件內(nèi)的曲線擬合函數(shù)直接算出(Figure 3)。

Figure 1. 存活力染料的活細胞檢測

Calcein AM染色的活細胞，使用SoftMax Pro軟件內(nèi)的細胞增殖分析模塊進行鑒定，此分析采用計算活細胞覆蓋面積占孔面積的百分比。右側(cè)的紫色蒙圖(masks)顯示出活細胞的分布，可在左側(cè)圖片內(nèi)觀察到。

Figure 2. 快速檢測細胞增殖率

在肝細胞毒性實驗中，通過熱圖數(shù)據(jù)結(jié)果可以快速顯示哪種化合物具有細胞毒性。紅色孔是細胞貼壁最多的，而藍色孔則是貼壁最少的，圖中可看出E-H排是細胞毒性最高的，A,M-P排則是無細胞的孔。

Figure 3. 化合物IC50值由曲線擬合給出

采用SoftMax Pro軟件的曲線擬合功能，確定四種不同的化合物的IC50值。

神經(jīng)元

神經(jīng)元的毒性體現(xiàn)在數(shù)量減少或神經(jīng)突觸的長度減少上(甚至存在于不影響細胞的數(shù)量或存活力的情況下)。通過成像實驗不僅可以檢測神經(jīng)元細胞的主體，同時還可以檢測神經(jīng)元細胞的軸突和樹突，提供了更多的細胞生長信息。
iPSC-神經(jīng)元細胞以5,000 cells/孔種于384孔板，培養(yǎng)5天，然后加入按照1:2梯度稀釋的視黃酸，四復(fù)孔排列，24小時處理，然后固定細胞，并使用AlexaFluor 488標記的微管蛋白抗體染色。
每個觀察視野可以觀測超過2000個細胞，接近30%的孔面積，然后使用SoftMax Pro軟件內(nèi)的細胞計數(shù)分析模塊進行分析(Figure 4)。

毒性實驗的更多信息

SpectraMax MiniMax 細胞成像系統(tǒng)可以提供細胞圖像數(shù)據(jù)和細胞形態(tài)信息，可以補充讀板機只有熒光強度的微孔板數(shù)據(jù)。其他如細胞計數(shù)、細胞密度等參數(shù)設(shè)置在評價化合物的iPSC肝細胞或神經(jīng)元細胞毒性方面有著很高價值。

Figure 4. 視黃酸對于神經(jīng)突增生的濃度依賴抑制效應(yīng)

覆蓋 (%)

Top:隨著視黃酸的濃度增加(從上往下，第一排為對照)，神經(jīng)軸突的生長減少。紫色疊圖(右列)為識別的細胞和神經(jīng)軸突。
Right:根據(jù)濃度和疊圖區(qū)域面積進行曲線擬合作圖