使用酶標(biāo)儀的細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)簽蛋白的表達(dá)-Molecular Devices SpectraMax I3

優(yōu)勢(shì)：

1.   帶細(xì)胞成像系統(tǒng)的功能模塊擴(kuò)展了微孔讀板機(jī)的檢測(cè)應(yīng)用
2.   方便檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞或每孔的標(biāo)簽蛋白的表達(dá)水平
3.   按照一般微孔讀板機(jī)的簡(jiǎn)單流程
4.   細(xì)胞可視化數(shù)據(jù)輸出，增加了數(shù)據(jù)可信性

某些細(xì)胞蛋白存在或不存在，可代表著細(xì)胞對(duì)某些刺激的反應(yīng)、某種分化的狀態(tài)或特定細(xì)胞類型的獨(dú)特特征或者基因的成功轉(zhuǎn)染。如血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)一般不存在于正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞，但在細(xì)胞因子TNF-α的體外刺激引起的炎癥反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)VCAM-1的表達(dá)。這種細(xì)胞中某種特殊標(biāo)志蛋白的表達(dá)，可以很容易地使用微孔板成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)和定量。

定量測(cè)量細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在96孔板中培養(yǎng)48小時(shí)，接著使用抗炎化合物SB202和SB203的不同劑量刺激2小時(shí)；然后使用TNF-刺激24小時(shí)，細(xì)胞表達(dá)VCAM-1；然后用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞，接著使用抗VCAM熒光素標(biāo)記的抗體染色。使用S p e c t r a M a x M i n iMax細(xì)胞成像系統(tǒng)(SpectraMax i3多功能讀板機(jī)的用戶可升級(jí)模塊)進(jìn)行細(xì)胞成像，影像分析使用Soft-Max Pro軟件內(nèi)的蛋白表達(dá)Protocol實(shí)時(shí)進(jìn)行。使用SoftMax Pro的濃度效應(yīng)曲線擬合，進(jìn)行化合物的藥效的評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示化合物成功地抑制了細(xì)胞因子的刺激，從而抑制了后續(xù)的VCAM-1的表達(dá)。

VCAM-1的表達(dá)水平的定量，通過(guò)設(shè)置熒光強(qiáng)度閾值過(guò)濾掉背景熒光和大小閾值過(guò)濾掉微小的雜質(zhì)，如劃痕，顆�；驓馀�。圖1表示在SoftMax Pro中如何進(jìn)行蛋白標(biāo)志物的分析設(shè)置程序。

熒光素標(biāo)記的VCAM抗體染色的固定細(xì)胞，使用標(biāo)簽蛋白表達(dá)程序進(jìn)行鑒定，由于細(xì)胞幾乎連成一片，所以此程序設(shè)置為檢測(cè)整個(gè)視野內(nèi)蛋白總體表達(dá)，而非是進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖1 陽(yáng)性和陰性樣品讀板前的測(cè)試分析參數(shù)設(shè)置

圖1， SoftMax Pro軟件界面擁有幾個(gè)可視化的組件，以幫助建立圖像分割最佳參數(shù)設(shè)置。
1：調(diào)整背景強(qiáng)度和對(duì)象大小閾值來(lái)識(shí)別熒光細(xì)胞。
2：在陽(yáng)性和陰性孔內(nèi)，可視化生成的分割遮罩，以幫助判斷是否需要進(jìn)一步的參數(shù)調(diào)整。
3：選擇能展示陽(yáng)性孔和陰性孔直接較大差異的輸出參數(shù)，如直方圖的顯示方式。
標(biāo)記的表達(dá)程序是用來(lái)識(shí)別熒光素標(biāo)記的抗VCAM抗體標(biāo)記的區(qū)域。 VCAM-1的存在表示
炎癥應(yīng)答的陽(yáng)性反應(yīng)。

圖2 細(xì)胞對(duì)抗炎化合物的反應(yīng)應(yīng)答

左側(cè)的圖像顯示熒光VCAM-1表達(dá)的細(xì)胞，右圖加上紫色遮罩，顯示軟件對(duì)表達(dá)炎癥標(biāo)簽蛋白的劃分；高劑量的抗炎化合物SB202處理的細(xì)胞(上排)顯示出很少的VCAM-1的表達(dá)，而低劑量的抗炎化合物SB202處理的細(xì)胞(下排)使用細(xì)胞因子后，則表達(dá)出大量的VCAM-1。所有的值為經(jīng)過(guò)歸一化處理后的總強(qiáng)度值。

標(biāo)記表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)的更多信息

SpectraMax MiniMax細(xì)胞成像系統(tǒng)可提供簡(jiǎn)單酶標(biāo)熒光強(qiáng)度檢測(cè)值所不能提供的可視化數(shù)據(jù)和信息。熒光檢測(cè)區(qū)域可定位到表達(dá)感興趣的標(biāo)簽的細(xì)胞，大的成像視野允許將數(shù)量龐大的細(xì)胞一次整合。友好的SoftMax Pro軟件分析界面，允許進(jìn)行濃度效應(yīng)曲線擬合和計(jì)算IC50值等�？傊�，MiniMax細(xì)胞成像系統(tǒng)簡(jiǎn)化了細(xì)胞成像過(guò)程，提供了和補(bǔ)充了在細(xì)胞標(biāo)簽蛋白表達(dá)檢測(cè)方面標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀檢測(cè)所不能提供的重要信息。