細(xì)胞技術(shù)專題：補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)原理

帶有特異抗原的靶細(xì)胞（如正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體的參與下，引起靶細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍(lán)）可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色，故可用于指示死細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞，而活細(xì)胞不著色。此即補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒試驗(yàn)，利用細(xì)胞毒試驗(yàn)可以檢查細(xì)胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。

本實(shí)驗(yàn)中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細(xì)胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補(bǔ)體的協(xié)同作用，可殺傷95％以上的胸腺細(xì)胞。

2、實(shí)驗(yàn)材料

（1）解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80～100目不銹鋼網(wǎng)；

（2）試管、lml吸量管、尖吸管；

（3）載玻片、蓋玻片；

（4）C57BL／6J小鼠；

（5）含5％NBS的冷Hank’s液；

（6）抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（最適稀釋度，本室制備）；

（7）補(bǔ)體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細(xì)胞吸收，預(yù)先測定效價(jià)并稀釋為最佳稀釋度)；

（8）1%伊紅-Y染液。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）小鼠胸腺細(xì)胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后，過篩，放入試管，離心1000rpm，5分鐘，用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸于Hank’s液中，配成1×107／ml細(xì)胞懸液。

（2）取試管3支，標(biāo)明順序，依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細(xì)胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分鐘。

（3）取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴，混勻，室溫放置2分鐘。

（4）重新混勻后分別在一張載玻片上滴片，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察，比較3管中細(xì)胞死活情況。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

死細(xì)胞呈紅色，無光澤且腫脹變大；活細(xì)胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。

高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)算其中死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：死細(xì)胞百分?jǐn)?shù)= EQ EQ \F(實(shí)驗(yàn)管死細(xì)胞數(shù)%-對照管死細(xì)胞數(shù)%,100%-對照管死細(xì)胞數(shù)%)

5、注意事項(xiàng)

（1）胸腺細(xì)胞制備速度要快，且需在冰浴中進(jìn)行操作，以保持細(xì)胞活力；

（2）抗Thy-1的單克隆抗體和補(bǔ)體的效價(jià)要在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定；

（3）細(xì)胞對照管死細(xì)胞數(shù)若超過5%，實(shí)驗(yàn)需重新做；

（4）細(xì)胞滴加到載玻片上后長時(shí)間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。