二手煙對細(xì)胞暴露及其對呼吸道病毒感染的易感性研究

二手煙對細(xì)胞暴露及其對呼吸道病毒感染的易感性研究目標(biāo)是了解二手煙的暴露對病毒性呼吸道疾病的形成有何促進(jìn)作用。本研究項目的目的是確定在病毒感染中二手煙霧暴露的影響，在肺上皮細(xì)胞模型，使用兩種流行的人類呼吸道病毒：鼻病毒和腺病毒。

腺病毒（AD）是無包膜DNA病毒，是兒科需要住院治療的呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原體。這些病毒也是造成急性呼吸道傳染性疾病爆發(fā)的主要原因。B類（如血清3型，7型和11型），C類（如血清5型），和E類（例如血清4型）是最常見的呼吸道病原體。

人鼻病毒（HRV）是小核糖核酸病毒家族的成員。這些高度多樣化的無包膜RNA病毒是重要的人類病原體和普通感冒的最常見的病原體。流行病學(xué)研究表明，HRV感染可能與哮喘和COPD病情加重有關(guān)。

我們推測，通過二手煙的暴露，增加受體分子的有效性和促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入，從而增加呼吸道病毒的感染。該研究的理論基礎(chǔ)是，確定二手煙暴露增加呼吸道感染易感性的機制， 進(jìn)而進(jìn)一步干預(yù)以減少呼吸道疾病。這一假設(shè)將通過三個明確的目標(biāo)進(jìn)行驗證：

目標(biāo) 1.

確定二手煙暴露對呼吸道上皮細(xì)胞的滲透性及病毒受體的數(shù)量和有效性的影響。

 

目標(biāo) 2.

確定二手煙暴露在體外對呼吸道病毒感染的氣道上皮細(xì)胞的影響。

 

目標(biāo) 3.

確定二手煙暴露對病毒感染促炎反應(yīng)的影響。

 

香煙相對濕度保持30%~40%。實驗中，細(xì)胞暴露于香煙煙霧8分鐘/次。主流香煙煙霧的每次吸煙量保持30.10ml。側(cè)流香煙煙霧保持在78.36ml。采用Cultex細(xì)胞暴露系統(tǒng)（Hannover,Germany），細(xì)胞體外的氣-液（ALI）培養(yǎng)，并在氣-液界面進(jìn)行香煙煙霧的高效暴露。

 

  

在transwell上極化Calu3細(xì)胞，主流煙和測流煙暴露10～30分鐘后，結(jié)果TER(跨上皮電阻)值降低。主流煙暴露的細(xì)胞，TER值可以恢復(fù)；測流煙暴露的細(xì)胞，在實驗1～24小時內(nèi)TER值沒有恢復(fù)，表明暴露損傷為不可逆損傷。

 

可以觀察到，在MOI 1 PFU／cell的3個獨立感染實驗3天后，總的傳染性病毒產(chǎn)量沒有大的變化。然而，在煙霧暴露和感染Ad3p細(xì)胞中，傳染病毒產(chǎn)量有明顯的增加趨勢。

當(dāng)對頂層、細(xì)胞內(nèi)以及底部的感染病毒產(chǎn)量進(jìn)行評估時，發(fā)現(xiàn)在底部沒有檢測到病毒。有趣的是，在主流煙和測流煙感染Ad4和Ad5后的頂層和細(xì)胞內(nèi)病毒滴度有明顯的增加。在MOI  1.0 PFU/cell感染三天后的感染病毒的產(chǎn)量評估。

 

 

在MOT為10.0 PFU/cell,感染了非復(fù)制型Ad5-CMV-mCherry的Calu3細(xì)胞的mCherry熒光蛋白的表達(dá)量的熒光顯微鏡的檢查。過濾測流煙空氣的暴露實驗作為對比控制，10X倍數(shù)觀測。初步數(shù)據(jù)顯示，側(cè)流煙霧暴露導(dǎo)致進(jìn)入的感染病毒量增加。重復(fù)實驗并通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表達(dá)的mCherry的數(shù)量進(jìn)行定量評估。

  

 

   在1.0 PFU/cell MOI感染Ad3p，Ad4p和Ad5p6小時和18小時后，暴露于主流煙和測流煙，采用懸浮芯片檢測腺病毒感染Calu3細(xì)胞促炎細(xì)胞因子反應(yīng)。

 

總的來說，目前的實驗結(jié)果表明，如腺病毒，暴露于主流或側(cè)流煙霧沒有顯著提高受感染細(xì)胞的鼻病毒的復(fù)制。在MOI為0.1，0.5，1.0和5.0 PFU/cell的數(shù)據(jù)集之間沒有觀察到顯著可測量的差異。令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)是，可以在transwell系統(tǒng)的頂部，細(xì)胞和基底室單獨感染腺病毒的產(chǎn)量評估，并進(jìn)行類似的鼻病毒實驗，以提高我們的檢測差異的能力。

 

目前數(shù)據(jù)的初步分析表明，極化肺上皮細(xì)胞的香煙煙霧暴露（無論是主流煙和側(cè)流）導(dǎo)致可測量的增強腺病毒的復(fù)制。此外，這些細(xì)胞暴露于吸煙前，腺病毒感染加劇了他們在感染后18小時以上炎癥反應(yīng)，可能是由于增加了病毒進(jìn)入的結(jié)果。

 

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