轉(zhuǎn)基因大米中Bt基因的檢測(cè)方法

2014 年 7 月，央視日前報(bào)道了湖南、湖北、安徽、福建等4省存在轉(zhuǎn)基因大米的新聞，引發(fā)社會(huì)極大關(guān)注。記者在武漢市一家大型超市，隨機(jī)購買5種大米。經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，這 5 種大米中，有 3 種含轉(zhuǎn)基因成分：Bt63。Bt63 是一種抗蟲害的基因，它是蘇云金芽孢桿菌基因中的殺蟲晶體蛋白基因，可以有效防止鱗翅目等多種有害昆蟲。

 

近年來轉(zhuǎn)基因事件層出不窮，時(shí)有耳聞。那什么是轉(zhuǎn)基因呢？轉(zhuǎn)基因技術(shù)是提取特定生物體基因組中所需要的目的基因或者人工合成指定序列的DNA 片段，將該基因片段轉(zhuǎn)入特定生物中，與其本身的基因組進(jìn)行重組，獲得具有穩(wěn)定表現(xiàn)特定的遺傳性狀的個(gè)體。農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因通常是為了獲得抗病毒、抗蟲、抗寒、抗旱、抗?jié)�、抗鹽堿、抗除草劑等特性。

 

中國(guó)目前并未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化生產(chǎn)。歐盟委員會(huì)決議：中國(guó)大米產(chǎn)品必須憑不含轉(zhuǎn)基因Bt63大米成分的證書才能進(jìn)入歐盟市場(chǎng)。其解釋為：“轉(zhuǎn)基因作物只有經(jīng)過全面科學(xué)的評(píng)估和批準(zhǔn)，才能允許投放入歐洲市場(chǎng)。”這一決定目的在于防止未被批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因Bt63大米被歐洲消費(fèi)者購買和食用�？梢姶竺字蠦t基因的鑒別十分關(guān)鍵。檢測(cè)大米中Bt基因有較多方法，RephiLe 以《農(nóng)業(yè)部 953 號(hào)公告-6-2007_轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)抗蟲轉(zhuǎn) Bt 基因水稻定性 PCR 方法》 為基礎(chǔ)，推出大米 Bt 基因檢測(cè)解決方案，具體如下：

 

一、實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)轉(zhuǎn)基因大米特異性序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)試樣進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。對(duì) PCR 結(jié)     果進(jìn)行檢測(cè)，確定是否含有轉(zhuǎn)基因片段。

二、儀器和試劑

PCR 儀 MyCycler (biorad,USA)

臺(tái)式微量冷凍離心機(jī) Microfuge 22R （BeckmanCounter ,USA）

凝膠成像系統(tǒng) Gel DocTM XR（biorad,USA）

紫外檢測(cè)儀 NanoDrop1000 (eppendorf,German)

核酸電泳儀 EPS100 (上海天能)

超純水儀 Direct-Pure UP（RephiLe）

恒溫水浴 HH.S.21.8 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)

三、試驗(yàn)方法

1、試樣預(yù)處理

將大米粉碎，制成待測(cè)樣品。

2、基因組提取

使用 Axygen 基因組 DNA 小量試劑盒，按照其所述方法提取，UV 檢測(cè)含量。

3、引物設(shè)計(jì)

4、PCR 條件

反應(yīng)體系：使用 DBI 2xTaq PCR Master Mix，按照說明，加入模板及引物。

反應(yīng)條件：第一階段 95 ℃ 變性 5 min；第二階段 35 次循環(huán)：94 ℃ 變性 1 min，56 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s）；第三階段 72 ℃ 延伸 7 min。

5、核酸檢測(cè)

對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。SPS 擴(kuò)增產(chǎn)物大小 277 bp，Bt 擴(kuò)增產(chǎn)物大小 301 bp。

6、結(jié)果確認(rèn)

采用含 Bt 基因的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，確認(rèn)不含 Bt 基因的水稻做印性對(duì)照。陽性對(duì)照 SPS與 Bt 基因都擴(kuò)增出來，陰性對(duì)照只擴(kuò)增出 SPS 基因

待測(cè)樣本如擴(kuò)增出 SPS 基因，表明含水稻成份。

如擴(kuò)增出 SPS 基因和 Bt 基因，表明含轉(zhuǎn)基因水稻成份。

 

普通 PCR 實(shí)驗(yàn)只能確定樣本中是否含轉(zhuǎn)基因成份。需要確認(rèn)轉(zhuǎn)基因水稻含量可以通過Realtime PCR 實(shí)驗(yàn)。

 

PCR 實(shí)驗(yàn)對(duì)于實(shí)驗(yàn)用水的要求非常高，水中的污染物會(huì)造成不同的損害：金屬離子特別是 Mg 等會(huì)影響 Taq 酶的活性。有機(jī)物特別是腐殖酸和棕黃酸，會(huì)與 DNA 締合或者干擾酶，并影響熒光信號(hào)；DNA 酶會(huì)降解 DNA。細(xì)菌在代謝的過程中會(huì)釋放離子和有機(jī)物，產(chǎn)生各種干擾。因此，PCR 實(shí)驗(yàn)中必須使用無離子，無有機(jī)物，無細(xì)菌的超純水。

 

為保證 PCR 實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)配備高質(zhì)量的超純水儀來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，例如，中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)所、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)袁隆平實(shí)驗(yàn)室等國(guó)內(nèi)知名生物實(shí)驗(yàn)室使用的是RephiLe Direct-Pure UP 超純水儀。Direct-Pure UP 超純水儀以自來水為進(jìn)水，生產(chǎn) RO 純水和超純水。它采用兩組大容量的雙管純化柱，有效去除水中的痕量金屬離子，產(chǎn)水電阻率可達(dá)到 18.2 MΩ•cm。內(nèi)部超純水定時(shí)循環(huán)，配合雙波長(zhǎng)紫外燈可以降低水中的有機(jī)物水平至 5 ppb 以下。終端特別配置超濾除熱原柱，可以有效去除細(xì)菌和熱原等生物大分子物質(zhì)。Direct-Pure UP 超純水儀適合包含 PCR 在內(nèi)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)使用。RO 純水可以用于洗滌實(shí)驗(yàn)器皿，超純水可以配置電泳 Buffer，做空白對(duì)照等。

 

轉(zhuǎn)基因是一門嚴(yán)肅的科學(xué)，民眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因食物的安全性信任度非常低，對(duì)于轉(zhuǎn)基因棉花之類的非食用作物則相對(duì)較高�，F(xiàn)階段所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都不能證明轉(zhuǎn)基因食物對(duì)于食用者的健康造成影響。當(dāng)然，轉(zhuǎn)基因問世時(shí)間也不長(zhǎng)，其實(shí)驗(yàn)樣本的數(shù)量還較低，長(zhǎng)效結(jié)果還無法驗(yàn)證。生命科學(xué)是一門非常廣闊的科學(xué)，可能窮盡一生時(shí)間也無法徹底研究完。我們支持轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，這對(duì)緩解日益增長(zhǎng)的糧食需求有很大幫助；但是，商業(yè)化轉(zhuǎn)基因食品需要由民眾自由選擇，轉(zhuǎn)基因食品必須帶有明確的標(biāo)識(shí)，每個(gè)人都有權(quán)利選擇。隨著轉(zhuǎn)基因研究的不斷深入，終有一日，安全的轉(zhuǎn)基因食物會(huì)走入千家萬戶，為世界的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。