水環(huán)境污染生物監(jiān)測——生物測試法

水環(huán)境污染生物監(jiān)測——生物測試法

利用生物受到污染物危害或毒害后所產(chǎn)生的反應(yīng)或生理機能的變化來評價水體污染狀況，確定毒物安全濃度的方法稱為生物測試法。該方法有靜水式生物測試和流水式生物測試兩種。前者是把受試生物放于不流動的試驗溶液中，測定污染物的濃度與生物中毒反應(yīng)之間的關(guān)系，從而確定污染物的毒性；后者把受試生物放于連續(xù)或間歇流動的試驗溶液中，測定污染物濃度與生物反應(yīng)之間的關(guān)系。測試分為短期(不超過96h)的急性毒性試驗和長期(如數(shù)月或數(shù)年)的慢性毒性試驗。在一個試驗裝置內(nèi)，測試生物可以是一種，也可以是多種。測試工作可在實驗室內(nèi)進行，也可在野外污染水體中進行。

1、水生生物毒性試驗

進行水生生物毒性試驗可用魚類、溞類、藻類等，其中魚類毒性試驗應(yīng)用較廣泛。

魚類對水環(huán)境的變化反應(yīng)十分靈敏，當水體中的污染物達到一定濃度或強度時，就會引起系列中毒反應(yīng)。例如：行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變，直至死亡。魚類毒性試驗的主要目的是尋找某種毒物或工業(yè)廢水對魚類的半數(shù)致死濃度與安全濃度，為制定水質(zhì)標準和廢水排放標準提供科學(xué)依據(jù)；測試水體的污染程度和檢查廢水處理效果等。有時魚類毒性試驗也用于一些特殊目的，如比較不同化學(xué)物質(zhì)毒性的高低，測試不同種類魚對毒物的相對敏感性，測試環(huán)境因素對廢水毒性的影響等。下面介紹靜水式魚類急性毒性試驗。

（1）供試驗魚的選擇和馴養(yǎng)。

金魚來源方便，常用于試驗。要選擇無病、活潑、魚鰭完整舒展、食欲和逆水性強、體長(不包括尾部)約3cm的同種和同齡的金魚。選出的魚必須先在與試驗條件相似的生活條件(溫度、水質(zhì)等)下馴養(yǎng)7d以上；試驗前一天停止喂食；如果在試驗前四天內(nèi)發(fā)生死亡現(xiàn)象或發(fā)病的魚高于10％，則不能使用。

（2）試驗條件選擇。

每種濃度的試驗溶液為一組，每組至少10條魚。試驗容器用容積約10L的玻璃缸，保證每升水中魚質(zhì)量不超過2g。

試驗溶液的溫度要適宜，對冷水魚為12~28℃，對溫水魚為20～28℃。同一試驗中，溫度變化為±2℃；試驗溶液中不能含大量耗氧物質(zhì)，要有足夠的溶解氧，對冷水魚DO≥5mg／L，對溫水魚DO≥4mg／L；試驗溶液的pH應(yīng)為6.7～8.5，試驗期間pH波動范圍不得超過0.4個pH單位；硬度影響毒物毒性，一般來說，硬水可降低毒物毒性，而軟水可增強毒物毒性，因此，必須注意檢測試驗溶液的硬度，并在報告中注明。硬度應(yīng)為50～250mg／L(以CaCO₃計)。

配制試驗溶液和馴養(yǎng)魚用的水應(yīng)是未受污染的河水或湖水。如果使用自來水，必須經(jīng)充分曝氣才能使用。不宜使用蒸餾水。

（3）試驗步驟。

①預(yù)試驗(探索性試驗)：為保證正式試驗順利進行，須經(jīng)探索性試驗確定試驗溶液的濃度范圍，即通過觀察24h(或48h)魚類中毒的反應(yīng)和死亡情況，找出不發(fā)生死亡、全部死亡和部分死亡的濃度。

②試驗溶液濃度設(shè)計：合理設(shè)計試驗溶液濃度，是試驗成功的重要保證，通常選7個濃度(至少5個)，濃度間隔取等對數(shù)間距，例如：10.0、5.6、3.2、1.8、1.0(對數(shù)間距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(對數(shù)間距0.1)，其單位可用體積分數(shù)(如廢水)或質(zhì)量濃度(mg／L)表示。另設(shè)一對照組，對照組在試驗期間魚死亡率超過10％，則整個試驗結(jié)果不能采用。

③試驗：將試驗用魚分別放人盛有不同濃度溶液和對照水的玻璃缸中，并記錄時間。前8h要連續(xù)觀察和記錄試驗情況，如果正常，繼續(xù)觀察，記錄24h、48h和96h魚的中毒癥狀和死亡情況，供判定毒物或工業(yè)廢水的毒性。

④毒性判定：半數(shù)致死量(LD₅₀)或半數(shù)致死濃度(LC₅₀)是評價毒物毒性的主要指標之一。

求LC₅₀的簡便方法是將試驗用魚死亡半數(shù)以上和半數(shù)以下的數(shù)據(jù)與相應(yīng)試驗溶液毒物(或廢水)濃度繪于半對數(shù)坐標紙上(對數(shù)坐標表示毒物濃度，算術(shù)坐標表示死亡率)，用直線內(nèi)插法求出。將三種試驗時間試驗魚死亡半數(shù)以上和半數(shù)以下最接近半數(shù)的死亡率數(shù)值與相應(yīng)廢水濃度數(shù)值的坐標交點標出，并分別連接起來，再由50％死亡率處引一橫坐標的垂線，與上述三線相交，由三交點分別向縱坐標作垂線，垂線與縱坐標的交點處濃度即為LC₅₀，可見24h、48h和96h的LC50分別為5.2％、4.7％、4.4％。

⑤魚類毒性試驗的應(yīng)用：魚類毒性試驗的一個重要目的是根據(jù)試驗數(shù)據(jù)估算毒物的安全濃度，為制定有毒物質(zhì)在水中的最高允許濃度提供依據(jù)。

目前應(yīng)用比較普遍的是最后一種。對易分解、積累少的化學(xué)物質(zhì)一般選用的系數(shù)為0.05～0.1，對穩(wěn)定的、能在魚體內(nèi)高積累的化學(xué)物質(zhì)，一般選用的系數(shù)為0.01～0.05。

按公式計算出安全濃度后，要進一步做驗證試驗，特別是具有揮發(fā)性和不穩(wěn)定性的毒物或廢水，應(yīng)當用恒流裝置進行長時間(如一個月或幾個月)的驗證試驗，并設(shè)對照組進行比較，如發(fā)現(xiàn)有中毒癥狀，則應(yīng)降低毒物或廢水濃度再進行試驗，直到確認某濃度對魚是安全的，即可定為安全濃度。此外，在驗證試驗過程中必須投喂餌料。

2、發(fā)光細菌法

（1）方法原理

發(fā)光細菌是一類非致病的革蘭氏陰性微生物，它們在適當?shù)臈l件下能發(fā)射出肉眼可見的藍綠色光（450~490nm）。當樣品毒性組分與發(fā)光細菌接觸時，可影響或干擾細菌的新陳代謝，使細菌的發(fā)光強度下降或不發(fā)光。在一定毒物濃度范圍內(nèi)，有毒物質(zhì)濃度與發(fā)光強度成負相關(guān)線性關(guān)系，因而可使用生物發(fā)光光度計測定水樣的相對發(fā)光強度來監(jiān)測有毒物質(zhì)的濃度。

國家標準（GB/T 15441——1995）中，以氯化汞作為參比毒性表征廢水或可溶性化學(xué)物質(zhì)的毒性，也可用半數(shù)有效濃度（EC₅₀），即發(fā)光強度為最大發(fā)光強度一半時的廢水濃度或可溶性化學(xué)物質(zhì)的濃度來表征；選用明亮發(fā)光桿菌T₃亞種作為發(fā)光細菌。因該菌是一種海洋細菌，故水樣和參比毒物溶液應(yīng)含有一定濃度的氯化鈉。

目前，常采用新鮮發(fā)光細菌培養(yǎng)法和冷凍干燥發(fā)光菌粉制劑法。

（2）測定要點

①試驗材料的準備：專用生物毒性測試儀，發(fā)光細菌瓊脂培養(yǎng)液，液體培養(yǎng)基，0.02~0.24mg/L系列HgCl₂標準溶液，新鮮明亮發(fā)光桿菌T₃亞種或明亮發(fā)光桿菌凍干粉，化學(xué)毒物或綜合廢水等。

②新鮮發(fā)光細菌懸液的制備：從明亮發(fā)光桿菌的菌種斜管面中挑取一環(huán)細菌接種于新的發(fā)光細菌瓊脂斜面上，待斜面長滿菌苔并明顯發(fā)光時加入適量稀釋液并制成菌懸液；取0.1mL菌懸液接種于50mL液體培養(yǎng)基中，在22℃搖床震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（12~14h），用稀釋液將菌懸液稀釋成5×10⁷個（細胞）/[mL（菌懸液）]，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

③樣品測定：將過濾去除顆粒物雜質(zhì)的待測水樣加入占水樣質(zhì)量3％的NaCl，依次加入稀釋液和待測水樣，恒溫（20±0.5）℃后加入等量發(fā)光細菌懸液，依次測其發(fā)光強度。

④測試結(jié)果分析：根據(jù)測得的待測水樣的發(fā)光強度計算其相對折光率。

3、致突變和致癌物檢測

致突變和致癌物也稱誘變劑，其檢測方法有微核測定法、艾姆斯(Ames)試驗法、染色體畸變試驗法等。

微核測定法原理基于：生物細胞中的染色體在復(fù)制過程中常會發(fā)生一些斷裂，在正常情況下，這些斷裂絕大多數(shù)能自行愈合，但如果受到外界誘變劑的作用，就會產(chǎn)生一些游離染色體斷片，形成包膜，變成大小不等的小球體(微核)，其數(shù)量與外界誘變劑強度成正比，可用于評價環(huán)境污染水平和對生物的危害程度。該方法所用生物材料可以是植物或動物組織或細胞。植物廣泛應(yīng)用紫露草和蠶豆根尖。紫露草以其花粉母細胞在減數(shù)分裂過程中的染色體作為誘變劑的攻擊目標，把四分體中形成的微核數(shù)作為染色體受到損傷的指標，評價受危害程度。蠶豆根尖細胞的染色體大，DNA含量多，對誘變劑反應(yīng)敏感。

Ames試驗是利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)生回復(fù)突變的性能來檢測被檢物是否具有致突變性。這種菌株均含有控制組氨酸合成的基因，在不含組氨酸的培養(yǎng)基中不能生長，但如果存在致突變物時，便作用于菌株的DNA，使其特定部位發(fā)生基因突變而回復(fù)為野生型菌株，能在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長�？紤]到許多物質(zhì)是在體內(nèi)經(jīng)代謝活化后才顯示出致突變性的，Ames等人采用了在體外加入哺乳動物肝微粒體酶系統(tǒng)(簡稱s一9混合液)使被檢物活化的方法，提高了試驗的可靠性。

色體畸變試驗是依據(jù)生物細胞在誘變劑的作用下，其染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如染色單體斷裂、染色單體互換等，以此檢測誘變劑及其強度。

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