使用冷凍分裝技術(shù)提高糞便微生物菌群研究的效率和質(zhì)量：突破處理糞便樣本難題

作者：Graham S. Long, Joseph M. Fraone, and Larry Chin

 

 

目前，腸道微生物菌群研究已經(jīng)成為科學(xué)研究領(lǐng)域越來越重要的一個方向，腸道微生物菌群研究在藥物研發(fā)、營養(yǎng)學(xué)研究、疾病預(yù)防和診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價值，潛力巨大。然而，糞便樣本除了物流運(yùn)輸這一關(guān)鍵步驟以外，還面臨著健康和安全性的系列挑戰(zhàn)，同時直接接觸這些樣本往往也是不受歡迎的操作處理方式。

 

因?yàn)榧S便樣本一般呈半固體狀態(tài)，難以使用傳統(tǒng)的人工或者自動化液體工作站進(jìn)行操作，由于高通量操作能力的限制，所以很難將小型實(shí)驗(yàn)性研究升級成大型項(xiàng)目型研究。

  

針對以上描述的各項(xiàng)困難與挑戰(zhàn)，  種新型、高效的冷凍樣本分裝技術(shù)為其提供了相應(yīng)的解決方案。通過將糞便樣本保持在冷凍狀態(tài)下（溫度控制在-80C或以更低水平），消除凍融循環(huán)，可以很好地保存微生物菌群的活體特征。此外，冷凍樣本分裝提供一種安全且一致性的樣本操作方法。由于抑制了令人不悅的氣味產(chǎn)生，幫助實(shí)驗(yàn)人員輕松的處理更多的糞便樣本，改善了實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

 

目前市面上僅有兩款儀器可以用于實(shí)驗(yàn)室的冷凍樣本分裝操作。一款是桌面型半自動化儀器，可容納并處理市面上大部分的樣品管規(guī)格，適合于較小規(guī)模的試驗(yàn)性研究面上大部分的樣品管規(guī)格，適合于較小規(guī)模的試驗(yàn)性研究和方法開發(fā)工作。另一款是落地式全自動化操作平臺，適合標(biāo)準(zhǔn)化流程作業(yè)和以及大群組樣品類型的項(xiàng)目型研究工作。兩種儀器都可以處理冷凍的原始糞便樣本，或冷凍的懸浮處理糞樣本，目前正廣泛應(yīng)用于各個知名的腸道微生物組研究實(shí)驗(yàn)室。

 

 

在當(dāng)前的研究中，收集和處理人類糞便樣本用于分析腸道微生物菌群面臨諸多挑戰(zhàn)，不僅在收集流程以及物流運(yùn)輸?shù)陌踩�性上，還有維持樣本呈現(xiàn)在體內(nèi)狀態(tài)時的分子譜的完整性上，存在著許多難以解決的問題。由于每個排泄物樣本的固化程度、水合作用程度以及組成物質(zhì)有很大的不同，這就給通過物理手段上處理并通過標(biāo)準(zhǔn)化取定量的樣品進(jìn)行分析造成了很大的困難。又因?yàn)楣腆w顆粒物會堵塞槍頭，即使研究人員采用糞便懸液樣本，也難以實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)液體自動化處理。盡管在轉(zhuǎn)移和處理樣本的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性上存在一定的困難，但另一個更重要的核心問題就是如何保持微生物分子生物方面的完整，因?yàn)榧S便樣本中充滿了大量核酸酶和RNA酶，他們的存在使得RNA和元基因組的分析變得更為困難。

 

通過消除反復(fù)凍融的操作，保持活體微生物遺傳圖譜特性。

冷凍取樣技術(shù)可整合到基因組研究的工作流程中，提高研究效率，最大限度地提高樣本存儲率。

可對原始樣本進(jìn)行重復(fù)取樣，無需進(jìn)行反復(fù)凍融即可滿足對樣品進(jìn)行冷凍分裝的需求。

 

為了使糞便樣本中的核酸含量保持穩(wěn)定，科學(xué)家們已經(jīng)嘗試了多種不同的方法，包括加入復(fù)合種類的酶抑制劑、在緩沖液中添加lOOmM的EDTA、還原劑以及乙醇混合物，低溫凍存樣本甚至對樣品進(jìn)行凍干處理。

 

針對以上困難，我們提出了一種全新的樣本處理方法，可以在盡量保證樣本遺傳信息完整性和降低分子譜變化的潛在風(fēng)險。通過冷凍樣本取樣，在分析之前，我們可以讓樣本在處理、轉(zhuǎn)移和存儲的整個過程中保持冷凍狀態(tài)，從而保持糞便樣本的分子譜完整性。此外，通過冷凍取樣技術(shù)，我們可真正實(shí)現(xiàn)半自動化／全自動化技術(shù)來處理更多的糞便樣本，最大限度地避免操作人員暴露于潛在的有害物質(zhì)中，進(jìn)一步規(guī)范作業(yè)流程。例如像瑞士洛桑聯(lián)邦理工大學(xué)(EPFL)的雀巢健康科學(xué)院和盧森堡聯(lián)合生物樣本庫(IBBL)等實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地將半自動桌面型冷凍取樣技術(shù)應(yīng)用于他們的腸道微生物組的研究工作中。法國國家農(nóng)業(yè)研究院(INRA)則在其大型研究項(xiàng)目工作中采用了全自動化的技術(shù)方案（CXT750冷凍樣品取樣儀），實(shí)現(xiàn)了樣本處理和存儲工作流程的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

 

圖1：冷凍樣品取樣儀與法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(INRA)糞便微生物菌群研究流程進(jìn)行整合

 

圖2：冷凍樣品取樣和人工取樣的冷凍糞便樣本的宏基岡組比較   在宏基因組分析處理之前，按照以下三個條件，對II名志愿者的糞便樣本進(jìn)行處理。條件1：人工分裝的冷凍糞便樣本，和來自經(jīng)過固定、均相并在室溫下放置了一周后的進(jìn)行冷凍分裝樣本進(jìn)行比較：條件2：將手動取樣的冷凍糞便樣本與穩(wěn)定的、均勻的、在環(huán)境溫度下貯存l周的經(jīng)冷凍取樣的糞便樣本進(jìn)行對比：條件3：人工分裝的冷凍糞便樣本，和來自經(jīng)過固定、均相并在-80℃存放一周后的進(jìn)行冷凍分裝樣本進(jìn)行比較。對每個條件下的樣本進(jìn)行測序，并使用Spea rman軟件進(jìn)行宏基因組的數(shù)據(jù)比較分析，以比較并確定每種取樣技術(shù)的差異。所有條件都顯示出高分值的相關(guān)性(>0 8)。其中，條件3相關(guān)性最佳，條件1相關(guān)性最差。

 

 

任何腸道微生物研究工作的起點(diǎn)都是從患者和志愿者那里收集糞便樣本，收集方法會根據(jù)操作流程和容器的不同而有所差異。考慮到研究項(xiàng)目的性質(zhì)、規(guī)模以及存儲要求，樣本會被保存為原始狀態(tài)或者進(jìn)行懸浮處理�？紤]到收集容器的類型和采集后的樣本制備，冷凍樣品取樣技術(shù)能夠處理大部分類型的冷凍糞便樣本規(guī)格。CXT350冷凍樣品取樣儀擅長處理大多數(shù)類型的樣品收集容器，從2.0毫升小型凍存管到50ml的大型離心管，都可以快速進(jìn)行設(shè)置，以適應(yīng)當(dāng)目前種規(guī)格的管型。CXT750冷凍樣品取樣儀可以實(shí)現(xiàn)完全自動化的冷凍樣本處理，適用于分析通量要求更高的作業(yè)環(huán)境。如果在樣本收集時或者收集后立即對樣本進(jìn)行懸浮化或標(biāo)準(zhǔn)化處理，CXT 750將在標(biāo)準(zhǔn)化工作流程和集中存儲的實(shí)施過程中，成為強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)工具。

 

一般而言，冷凍糞便樣本可以根據(jù)需要隨時進(jìn)行提取樣，而母樣則始終保持在冷凍狀態(tài)（以供日后研究）。另外一種辦法是，根據(jù)預(yù)先計劃的研究項(xiàng)目需要或樣本庫建立/規(guī)格重排的需要，母樣本可直接被冷凍取樣等分為若干數(shù)量的子樣本，方便日后使用。

 

該方法僅在無需對母樣本進(jìn)行保留時使用。

 

無論是否采用冷凍取樣方法，在沒有多次的反復(fù)凍融的情況下，冷凍取出的樣本都可直接用于大多數(shù)核酸提取工作。法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的研究人員近期通過冷凍取樣技術(shù)，驗(yàn)證了這一技術(shù)在糞便/腸道微生物研究領(lǐng)域的作用（參見圖1）。法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院將冷凍取樣技術(shù)與之前的取樣方法進(jìn)行對比，進(jìn)一步研究這一新技術(shù)是否適用于他們擬實(shí)施的研究項(xiàng)目。

 

 

經(jīng)大量研究證實(shí)：我們的腸道菌群與健康、疾病之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)，所以，腸道微生物組研究的重要性正變得越來越明顯。由于越來越多的證據(jù)可以證明：不同的腸道微生物菌群的形態(tài)與診斷、預(yù)后之間存在著極強(qiáng)的相關(guān)性，甚至是因果關(guān)系，科學(xué)家們因此也越加關(guān)注這一領(lǐng)域的研究。因此，涉及人類糞便樣本采集和分析的研究越來越多，規(guī)模也越來越大。目前，在人體腸道微生物菌群的研究中，想要有效和安全地處理大量半固態(tài)或懸浮態(tài)糞便樣本，冷凍樣品取樣技術(shù)是唯一可行的解決方案。

 

1該資料和數(shù)據(jù)由法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(INRA )MetaGenoPolis項(xiàng)日的Joel Dore博上提供。

 

可容納并處理市面上大部分的樣品管規(guī)格，亦可根據(jù)需要進(jìn)行定制，最大限度地提高了在實(shí)際應(yīng)用中的靈活性。

 

通過消除反復(fù)凍融的操作，保持活體微生物遺傳圖譜特性。

 

冷凍取樣技術(shù)可整合到基因組研究的工作流程中，提高研究效率，最大限度地提高樣本存儲率。