獲得高質(zhì)量土壤RNA的10個建議

前面的文章我們介紹了如何提取土壤DNA。大篇幅詳細講解了影響DNA得率和純度的研磨均質(zhì)、化學試劑（重點是裂解緩沖液）等問題。做DNA遠沒有做RNA壓力大。不用太擔心降解，得率還挺高。

提取土壤RNA是環(huán)境分子生物學研究最難的研究方法之一。RNA提取本身就是件艱巨的任務，提取土壤的RNA挑戰(zhàn)更大。最大的困難之一是土壤RNA得率。從土壤中獲得RNA遠比DNA少，前者僅有后者的10-20%，所以需要比提DNA更多的加樣量。因此需要用更大的研磨管（15ml）和更大的離心機。

另一個大問題是腐植酸等抑制因子的污染。RNA實驗對純度要求很高，當逆轉(zhuǎn)錄尋找低拷貝數(shù)基因時，你無法稀釋RNA樣品。要求加入反應體系中的RNA濃度足夠高且不能含有抑制因子。

提取土壤RNA需要特殊條件

因此，MO BIO開發(fā)出了一套不使用二氧化硅離心柱的方法來提取土壤RNA。下面討論關(guān)于RNA PowerSoil Kit以及何如獲得更好的提取效果。

這套操作流程包含了多種方法。IRT技術(shù)去除抑制因子，酚氯仿法最充分地裂解微生物細胞，陰離子交換技術(shù)更高的純化質(zhì)量。最終獲得非常干凈的RNA最大化地滿足RT-PCR的需要。

讓我們一起來討論如何使用這些技術(shù)，并盡可能少出錯返工。每個土壤樣品質(zhì)地、水分含量、微生物豐度都不一樣，在提取過程中出現(xiàn)的狀況不盡相同。下面我們重點討論幾個容易出錯的關(guān)鍵步驟，以及做哪些修改可以獲得更好的提取效果。

1. 樣品起始量

對于絕大多數(shù)類型土壤，2g土壤是最大的樣品起始量。然而，對于底泥這類含水量較高的土壤，本身實際土壤含量較低，微生物含量也不高，我最多用到5g的起始量。如果樣品加入到研磨珠套管后，發(fā)現(xiàn)上面有一層水。最好先離心并吸去多余的水分。

2. 酚氯仿異戊醇Phenol: Chloroform（步驟3）:

使用正確的PCI非常重要，在試劑盒操作說明書中我們給出了一些使用建議。PCI比例必須為25：24:1，pH介于6.7-8，并保存在pH8.0的TE緩沖液中。許多人提取動物組織和細胞習慣性地只使用低pH值的苯酚來提取RNA。而對于土壤，pH中性的苯酚會合適。

3. 優(yōu)化異丙醇濃縮（步驟9）:

PCI裂解步驟后加入SR3溶液，下一步加入異丙醇沉淀總核酸。如果你在做底泥，加完SR3溶液后總體積可能超過5ml。增加SR4（異丙醇）的使用量，至與步驟8獲得的樣品體積相同，以保證充分沉淀核酸。

4. 異丙醇沉淀的環(huán)境溫度（步驟9）：

原有的操作說明建議-20℃冷凍樣品。鹽濃度高的樣品核酸沉淀步驟請在室溫下進行。冷凍樣品沉淀的鹽分，會改變陰離子交換離心柱上的核酸吸附綁定條件。你可以從沉淀物中看出來是否有鹽分沉淀。正常的RNA沉淀表面平坦有光澤，若沉淀明顯較大且表面有殼，表明有鹽分沉積。底泥樣品水分大，就算是淡水湖也好，多余的水分會含鹽。若你的土壤類型在-20℃下孵育能獲得更理想的得率，請按照原方法進行。

暫停點：我曾經(jīng)把步驟9的孵育時間延長超過30min，甚至過夜，最終RNA依然完好。我不建議每個樣品都延長孵育時間，至少你的土樣樣品需要測試才能知道是否影響RNA質(zhì)量。只在特殊情況下，你可以稍微在此步驟暫停。

5. 陰離子交換離心柱溶液自然滴下（步驟14）

最后的RNA回收步驟使用的離心柱裝有樹脂，溶液利用重力通過離心柱。有時溶液通過樹脂的速度很慢，可適當施加正壓加速流動。通常我們的做法是用5ml注射器針管緩緩加壓，但流速不應該超過1滴每秒。

6. 搖、搖，搖勻SR5和SR6（步驟12）：

SR5和SR6使用前必須充分搖勻。有些含有異丙醇的溶液靜置會分層，使用前只要充分搖勻即可。

7. 節(jié)省洗提時間小提示（步驟16-20）：

有時候我會直接洗脫到2ml Collection Tube，而不用15ml Tube。確保離心柱垂直放置不會傾覆。只有摸透了技巧才好這么弄，謝絕新手。

8. 最后異丙醇沉淀（步驟17）：Final isopropanol precipitation (step 20):

從離心管中洗脫下來以后，加入異丙醇（SR4溶液）做最終沉淀。需要在-20℃孵育。此步必須在-20℃孵育（VS 室溫）。此步可適當延長時間。

暫停點：若提取工作沒辦法繼續(xù)完成，可在此步暫停過夜。樣品在-20℃冷凍，RNA能穩(wěn)定保存。

9. 沉淀RNA（步驟18）：

離心異丙醇分離RNA，正常RNA沉淀應小而呈玻璃光澤。離心時所有的Tube管要朝向一致，以便于倒出異丙醇時迅速辨認RNA沉淀。晾干RNA沉淀步驟需要快速完成。通常我們的做法是在超凈臺中把Tube管倒置在吸水紙上。

10. 重懸RNA（步驟20）:

現(xiàn)在，你有了漂亮的干燥沉淀。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄對體積的要求，重懸RNA。在我們實驗室里頭，若樣品土壤微生物非常豐富，我們會用50-100μl水重懸（通常最終濃度為100-20ng/μl）。底泥或干燥土壤微生物含量低，為了提高最終RNA濃度，我們用25μl水重懸。這一步可操作性很高，請根據(jù)你的需要加入適合的水量重懸沉淀。

額外提示：

用SR6溶液洗脫RNA以后，離心柱濾膜還有DNA在。你可以用含有高濃度鹽的SR8溶液（DNA Elution Accessory Kit組分）把基因組DNA洗脫下來。因為整個核酸提取過程動作相對溫和，你可以獲得更大分子量的DNA。陰離子交換離心柱的又一優(yōu)勢在于，你可以從同一個樣品中先后提取到RNA和DNA。

再一個額外提示：RNA穩(wěn)定性和土樣保存：

我們常被問到采樣后土樣中RNA的穩(wěn)定性，以及RNALater的使用。事實上RNALater并不兼容土壤。我們做過用RNALater在不同溫度和時間下對土壤RNA的保護試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著保存時間的延長，RNALater會令土樣釋放出更多的腐植酸，粘附在RNA上與RNA共同吸附于陰離子交換離心柱濾膜上難以去除。保存的時間越長，樣品顏色變得越深。

我們采樣時使用LifeGuard Soil Preservation Solution對土壤RNA進行保護，并且在運輸過程中能保證微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不變。

總結(jié)：

最具挑戰(zhàn)性的樣品提取就是土壤RNA。樣品中RNA非常不穩(wěn)定、含量很低，而且存在大量抑制因子和微生物源RNase。但是獲得高得率干凈RNA還是可以做到的。我希望以上十點小技巧能縮短你提取新土樣RNA的摸索過程。要是你有更多提取訣竅，不妨告訴我們。我們樂意聽到研究者通過某些步驟特定的修改獲得他們想要的結(jié)果。

產(chǎn)品鏈接：RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit