DNA純化去雜質(zhì)實(shí)驗(yàn)介紹

這周我們來討論一項(xiàng)常用的技術(shù)，即使常用但仍引起部分人核酸分離焦慮癥。那就是基因組DNA的純化去雜質(zhì)。

場(chǎng)景是這樣的：你有一份采自南太平洋中部一個(gè)偏僻小島上首次發(fā)現(xiàn)的古老蘭花品種根際土壤樣品。你使用了非PowerSoil Kit法提取其中的微生物DNA。最終DNA含有太多雜質(zhì)，無法PCR擴(kuò)增。因此需要去除腐植酸等PCR抑制因子。你需要所有的核酸分子通過全基因組鳥槍測(cè)序……怎么辦？

你致電MO BIO說了你的大概情況，而我們推薦了使用PowerClean Kit。PowerClean是不帶研磨珠套管的迷你版PowerSoil Kit。樣品經(jīng)過了IRT處理，重新洗脫得到干凈的DNA。等等…分光光度計(jì)讀數(shù)發(fā)生變化了！純化前顯示有300ng/μl的DNA，現(xiàn)在卻只有30ng/μl。有比這更可怕的噩夢(mèng)嗎？你的DNA大量丟失了！

先別急。可以告訴你，你的DNA現(xiàn)在是安全并且干凈的。使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法純化DNA前后到底發(fā)生什么事，下面向你解釋：

我想先回到之前寫的一篇關(guān)于環(huán)境樣品粗提DNA中雜質(zhì)誤導(dǎo)UV260得率檢測(cè)結(jié)果的文章。這點(diǎn)非常關(guān)鍵，因?yàn)榘殡S土壤、水樣、生物薄膜、植物組織等樣品一起被提取出來的有機(jī)抑制因子會(huì)影響波長(zhǎng)260測(cè)量DNA得率讀數(shù)的準(zhǔn)確性（也抑制PCR擴(kuò)增）。如果采用CTAB法或苯酚氯仿法提取，降解的小分子RNA也會(huì)影響讀數(shù)。沒有使用抑制因子去除技術(shù)的硅膠離心柱型試劑盒、使用強(qiáng)力綁定鹽溶液無差別地綁定吸附DNA和RNA等因素同樣影響得率檢測(cè)數(shù)據(jù)。

好消息是，一旦這些影響因素被去除，最新的讀數(shù)才代表真正的得率

下面我們來看一下在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)手段（分光光度法和瓊脂凝膠電泳）下DNA的情況是如何被展示的。我們從分光光度法開始，下面展示了幾個(gè)使用及未使用IRT技術(shù)提取的土壤樣品結(jié)果。首先注意到的是DNA得率讀數(shù)ng/ul。這個(gè)讀數(shù)很重要，但也只是告訴你事實(shí)的一小部分。。

縱覽整個(gè)表格

 

260/230比率告訴我們這個(gè)DNA有問題。讀數(shù)低于1.0，表示含有高水平的抑制因子。我們還能從320讀數(shù)中看到另一個(gè)重要的信息。與下列的樣品相比，上面的樣品讀數(shù)高出10倍。腐殖酸在波長(zhǎng)320吸光度最強(qiáng)，因此340處的高吸光度值表示最終DNA中含有大量腐殖酸。260/230比值，加上較高的320吸光度，表明DNA很不干凈，且是由有機(jī)雜質(zhì)引起的。

吸光光度法提供了所有波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)。我們能清楚地看到在整個(gè)波段檢測(cè)中雜質(zhì)的情況。讀數(shù)開始很高并持續(xù)放大。曲線的中部抑制因子集中的地方260讀數(shù)一直高于正常位置。

但是，這還是很難讓所有人相信，最終溶液中并不全是DNA。所以，最好的確認(rèn)結(jié)果的辦法是瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖中有分光光度法無法看到的信息，DNA的完整性和直觀的得率�，F(xiàn)在我們看到的情況完全不一樣。雖然分光光度法顯示未使用IRT技術(shù)的DNA得率是使用了IRT技術(shù)得率的兩倍，而電泳圖上它卻沒有跑出相應(yīng)多的DNA。雜質(zhì)干擾了分析結(jié)果。這就是為什么我們常常建議同時(shí)用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳或picogreen檢測(cè)DNA。

那使用PowerClean Kit純化粗提DNA過程中發(fā)生了什么事？你去除DNA中的雜質(zhì)成分，結(jié)果得率讀數(shù)下降了。有些時(shí)候讀數(shù)能下降多達(dá)50%。但大分子DNA并沒有損失。丟失的只是你不想要的雜質(zhì)部分，討厭的PCR抑制因子浪費(fèi)你的時(shí)間和金錢�，F(xiàn)在DNA總算干凈了。

讓我們?cè)偕钊肓私獾诙�個(gè)誤導(dǎo)DNA得率的東東：RNA

許多提取方法會(huì)把RNA連同DNA一起提取出來。雖然這部分RNA分子并不完整，但仍會(huì)吸收UV。使用苯酚和氯仿提取核酸，以及等份強(qiáng)綁定鹽溶液、酒精吸附DNA法都會(huì)把RNA提出來。因?yàn)榉止夤舛确ú⒉荒軈^(qū)分DNA和RNA。這就是為什么只檢測(cè)DNA部分的Picogreen法結(jié)果會(huì)更準(zhǔn)確。瓊脂糖凝膠電泳能直觀地看到RNA彌散帶，對(duì)結(jié)果判斷更有幫助。

 

在這個(gè)例子中我們提取了過夜孵育的大腸桿菌純培養(yǎng)，每樣4ml。從電泳圖上能清晰看到底部彌散的降解RNA（條帶4-6）。分光光度法和Picogreen讀數(shù)對(duì)比結(jié)果列在了右邊。Picogreen的結(jié)果顯示，DNA的得率要比分光光度法讀數(shù)低60%。有些樣品RNA能推高讀數(shù)高達(dá)70%。如此大的誤差必定會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

好消息是，MOBIO的試劑盒設(shè)計(jì)上只綁定DNA，不吸附RNA。從上圖結(jié)果看來，確保了分光光度法讀書的準(zhǔn)確性。根據(jù)需要，通過調(diào)整綁定條件還能增加或減少小片段核酸或RNA的捕捉效率。

所以，總結(jié)最后：做純化前后給DNA跑電泳。檢查濃度（得率）和完整新（DNA分子量大�。�，并與備用檢測(cè)方法（分光光度法或Picogreen）做對(duì)比檢查是否存在RNA或抑制因子。

開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)前對(duì)DNA樣品做個(gè)簡(jiǎn)單的檢查可節(jié)省你的時(shí)間，減緩焦慮情緒。請(qǐng)記住，試劑盒只能你給什么，他們出什么。你要的是干凈的DNA。事先知道你有多少DNA，對(duì)最終出來的DNA有個(gè)大概估計(jì)，做到心中有數(shù)。