質粒抽提過程中內毒素如何去除？

  內毒素，即脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）細胞膜的組成部分。細菌外膜的外層脂質部分是完全由內毒素分子所構成的。單個大腸桿菌細胞約包含兩百萬個LPS分子，每個LPS分子由疏水的脂質A（lipid A）部分、復雜的糖類殘基陣列部分及負電性的磷酸基團所組成。因此，每個內毒素分子都具有疏水域、親水域和電荷域，這使它在與其他分子相互作用時具有其獨特的自身性質。細菌在其活性生長期向其周圍微環(huán)境中散布少量的內毒素，在死亡時則釋放大量內毒素。

  在質粒制備的細菌細胞裂解過程中，內毒素分子被從外膜釋放到溶菌液中。

內毒素會對原代細胞和敏感培養(yǎng)細胞的DNA轉染過程造成重要影響，內毒素水平的升高會導致轉染效率的急劇下降。而且，使用不含內毒素的質粒DNA對于基因治療的相關應用至關重要，因為內毒素會導致發(fā)熱、內毒素性休克綜合癥，并會在動物和人體上激活補體級聯(lián)反應。內毒素也會干擾如巨噬細胞和B細胞一類免疫細胞的體外轉染實驗，導致免疫反應的非特異性激活。這些效應還包括對如IL-1和前列腺素等免疫介質的誘導性合成。為了避免對實驗結果的錯誤判斷，確保塑料制品、培養(yǎng)基、血清和質粒DNA中均無LPS污染十分重要。

內毒素分子的化學結構與性質，以及它們形成膠束結構的傾向性，都使得它們容易與質粒DNA共同被純化出來。例如，在CsCl超速離心法當中，CsCl結合的DNA很容易被內毒素分子所污染，因為在CsCl中內毒素與質粒——溴化乙錠復合物具有相似的密度。

在大尺寸DNA純化樹脂上，高分子量膠束樣內毒素很類似于高分子量的DNA分子；在陰離子交換色譜法當中，內毒素分子上的負電荷能夠與陰離子交換樹脂相互作用，從而導致內毒素與質粒DNA被共同純化下來。不過，質粒DNA中內毒素污染的水平很大程度上依賴于所使用的純化方法。QIAGEN Plasmid Kit和2xCsCl梯度離心法均能夠生成較低內毒素含量的高純度DNA。硅膠懸漿法純化出的DNA則含有顯著升高的內毒素污染。使用EndoFree Plasmid Kit抽提出的DNA僅含有可忽略不計的微量內毒素（<0.1EU /µg質粒DNA）。

各種質粒制備方法的內毒素污染與轉染效率*

* 宿主株系: DH5α; 質粒: pRSVcat. ;† 1 ng LPS = 1.8 EU. 
‡ 使用QIAGEN plasmid Kit所制備的質粒，其轉染成功率為100%。使用其他所有制備方法所得到的轉染效率以QIAGEN Plasmid Kit作為基準進行比較計算。

由于內毒素與鱟（Limulus polyphemus，馬蹄蟹）變形細胞中的可凝蛋白之間存在凝固反應，因此歷史上一般通過此凝固反應對內毒素進行檢測。今天人們則使用更為敏感的光度試驗（例如BioWhittaker公司所提供的動力學-QCL檢測），這類方法基于對鱟變形細胞裂解液（LAL），以及一種合成的生色底物的使用。LPS污染通常以內毒素單位（EU）來表示。通常1 ng LPS對應1–10 EU。

獲得專利的EndoFree Plasmid制備方法在標準的QIAGEN Plasmid純化方案中整合了對內毒素的去除步驟。使用QIAfilter Cartridge過濾中性的細菌裂解液，并加入專門的不含內毒素緩沖液（緩沖液ER）在冰上進行共同孵育。不含內毒素緩沖液能夠避免LPS分子與QIAGEN-tip中的樹脂結合，從而使每微克質粒DNA中含有的內毒素少于0.1EU。

以上信息來源于QIAGEN網(wǎng)站：

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/removal%20of%20bacterial%20endotoxins/ 

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