以單細(xì)胞的視角重新審視生命——Fluidigm CyTOF實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)應(yīng)用于人免疫系統(tǒng)研究

圖二、質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成

在Nolan實(shí)驗(yàn)室中任職期間，Bendall和他的同事們將蛋白磷酸化流式技術(shù)與質(zhì)譜流式技術(shù)結(jié)合起來。該實(shí)驗(yàn)室一直致力于流式細(xì)胞技術(shù)的改進(jìn)和相關(guān)單細(xì)胞檢測(cè)方法的開發(fā)，目前已經(jīng)成為該領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者。

通過將蛋白質(zhì)組學(xué)和高級(jí)數(shù)據(jù)分析方法有機(jī)結(jié)合，這個(gè)實(shí)驗(yàn)室成功的對(duì)在正常和病變細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行了研究，這種研究方法是革命性的。Bendall從他在Nolan實(shí)驗(yàn)室的這段時(shí)間中獲取了很多靈感，并把這些靈感用于自己的新實(shí)驗(yàn)室中。目前，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室仍然密切合作，并共享著他們的CyTOF系統(tǒng)。目前，Bendall的實(shí)驗(yàn)室隸屬于斯坦福大學(xué)病理系，位于斯坦福血液中心，在這里他重點(diǎn)研究人類造血和免疫系統(tǒng)，以及在健康或者病理（癌變，過敏和自身免疫性疾病）條件下的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。

圖三、利用CyTOF對(duì)骨髓的信號(hào)通路分析（SPADE分析）

于此同時(shí)，NHLBI和斯坦福的跨學(xué)科合作也正在進(jìn)行中，他們已經(jīng)在肺動(dòng)脈高壓（PAH）和自身免疫性疾病等領(lǐng)域開展了四個(gè)研究項(xiàng)目。他們的合作正好順應(yīng)了基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)日益融合的大趨勢(shì)。Bendall解釋說，基因組數(shù)據(jù)具有很寬的覆蓋面，而單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)則是在單細(xì)胞水平上測(cè)量有限的參數(shù)。在Bendall本人的工作中，首先利用組學(xué)開啟廣闊的思路，再一步步縮小他的假設(shè)�！拔也患傺b自己是一個(gè)單細(xì)胞分子生物學(xué)專家，”接著，他提起了一個(gè)在人過敏反應(yīng)領(lǐng)域的合作伙伴Steve Galli，他可以算得上該領(lǐng)域思想領(lǐng)袖，現(xiàn)任斯坦福大學(xué)病理系主任，是研究過敏反應(yīng)和過敏性免疫細(xì)胞功能方面的專家。

然而，Bendall是一個(gè)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和流式分析技術(shù)方面的專家。從理論上講，他可以在他的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流式細(xì)胞分析，然后將樣本帶到校園另一邊，將它們放到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。所以，他有可能很快就可以溝通大學(xué)廣場(chǎng)兩邊的世界。

看到知識(shí)共享的光明前景，同時(shí)又擁有實(shí)現(xiàn)它的手段，這令一直熱愛技術(shù)的Bendall非常興奮。通過多年來系統(tǒng)的科研訓(xùn)練，他已經(jīng)成為了一個(gè)研究蛋白的生物化學(xué)家。他本科的學(xué)習(xí)一開始專注于生物化學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域，隨后逐漸轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜領(lǐng)域。后來，他曾在一個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作，與另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作研究人類造血和胚胎干細(xì)胞。

研究中Bendall注意到，蛋白質(zhì)組學(xué)可以分析上千萬個(gè)細(xì)胞的總體狀況；而干細(xì)胞研究則需了解單個(gè)細(xì)胞的功能；這似乎是一個(gè)悖論。

 “當(dāng)真正的根本問題在于單細(xì)胞的功能時(shí)，對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行總體分析是很難奏效的�！� Bendall回憶道。

這需要大量的后續(xù)工作，因?yàn)橹挥懈信d趣的細(xì)胞正好是大多數(shù)時(shí)，對(duì)于總體的分析才是有效的。正是這種“技術(shù)上的障礙”讓Bendall來到了斯坦福，他來尋找一種解決此類問題的工具——那就是基于單細(xì)胞檢測(cè)的質(zhì)譜流式技術(shù)。

圖四、單細(xì)胞檢測(cè)的必要性：總體數(shù)據(jù)會(huì)掩蓋細(xì)胞多樣性

Bendall面臨的一大挑戰(zhàn)就是做人類的研究。在以人為研究對(duì)象時(shí)，所能動(dòng)用的手段更加有限——因?yàn)樽鰹檠芯繉?duì)象的人更不容易干預(yù)�！拔覀儾豢赡芘�一個(gè)籠子，把我們研究的人都養(yǎng)在里面�！盉endall笑道。我們可以敲除小鼠的一個(gè)基因，然后和了另一個(gè)帶有該基因的小鼠進(jìn)行對(duì)比。但是當(dāng)研究對(duì)象是人類時(shí)，我們往往必須在沒有干預(yù)的系統(tǒng)中比較不同細(xì)胞。Bendall利用單細(xì)胞分析來消除這種復(fù)雜性。其目標(biāo)是創(chuàng)建一套技術(shù)，闡明人體內(nèi)藥物作用和基因功能。

圖五、人為研究對(duì)象的挑戰(zhàn)在于：其所能動(dòng)用的技術(shù)手段更加有限

為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，Bendall正在重新設(shè)想其實(shí)驗(yàn)策略，將單細(xì)胞分析應(yīng)用于到相關(guān)的研究中。通常來講，在不同的平臺(tái)上檢測(cè)相同的樣本可以產(chǎn)生類似的數(shù)據(jù)，所以Bendall首先利用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析樣本，然后使用另一個(gè)平臺(tái)進(jìn)行更深入的研究。

“分化的干細(xì)胞——特別是在培養(yǎng)皿里時(shí)——是混雜著的一群細(xì)胞，”他說。逐個(gè)測(cè)量這些細(xì)胞有助于弄清群體存在的異質(zhì)性，并將它們分門別類，這有助于Bendall將注意力集中于特定的細(xì)胞種類，防止實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到生物本身多態(tài)性的影響。

目前Bendall’s實(shí)驗(yàn)室有幾個(gè)項(xiàng)目正在開展中，其中第一個(gè)是利用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究人體過敏性粒細(xì)胞群體。一方面，他正在觀察病人體內(nèi)與常規(guī)過敏性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞。另一方面，他正在將基本生物學(xué)研究與人胚胎干細(xì)胞研究結(jié)合。胚胎干細(xì)胞可以進(jìn)行基因操作，因此可以借此研究不同調(diào)節(jié)蛋白的功能。

盡管科學(xué)界幾十年前就知道了這些類型的細(xì)胞，Bendall解釋說，“我們還沒有真正理解所謂‘異質(zhì)性’的正常水平是什么樣，以及在過敏性疾病病例中它們是怎樣變化的�！彼�的研究也有可能應(yīng)用于斯坦福正在組織的過敏免疫治療臨床試驗(yàn)中。簡(jiǎn)單的說，Bendall的研究重點(diǎn)是“理解正常我們就可以理解異常。”

有時(shí)，正常是一開始就被忽視的。當(dāng)初Bendall來到諾蘭實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候，很多人在研究白血病。當(dāng)他們研究癌變的骨髓樣本時(shí)，Bendall也在利用CyTOF研究急性髓系白血病。他的第一個(gè)問題是簡(jiǎn)單明了：“健康的骨髓是什么樣子的？”但是實(shí)驗(yàn)室并沒有健康的骨髓樣本，所以Bendall建議他們就從那里開始。因?yàn)椴±韺W(xué)評(píng)分的基礎(chǔ)就是“它離正常有多遠(yuǎn)”，對(duì)正常組織進(jìn)行定量分析對(duì)于了解和預(yù)測(cè)組織異常至關(guān)重要。

圖六、利用CyTOF對(duì)正常人和AML病人骨髓的對(duì)比圖譜（分析方法：viSNE）

Bendall的第二個(gè)正在申請(qǐng)的項(xiàng)目，旨在探索單細(xì)胞技術(shù)如何應(yīng)用于血液學(xué)研究。多年來對(duì)人類造血系統(tǒng)的免疫學(xué)研究一直是研究的熱點(diǎn)，因?yàn)樗�與骨髓移植密切相關(guān)。在已有發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，Bendall希望通過對(duì)比移植成功以及出問題的病例骨髓內(nèi)發(fā)生的事件，來了解骨髓植入綜合癥發(fā)生的精細(xì)機(jī)制。所以他打算利用單細(xì)胞技術(shù)對(duì)其機(jī)制進(jìn)行精細(xì)分析。

“我們不要僅僅基于細(xì)胞表面Marker來厘清樣品的組成”Bendall說。“我們還可以利用胞內(nèi)的起調(diào)節(jié)作用的生化分子，正是它們影響了細(xì)胞的行為。”他的研究可能成為一項(xiàng)可行的臨床方法。例如，根據(jù)他的研究成果，如果一個(gè)人有太多的一種細(xì)胞類型而另一種卻不夠，治療方案就可能按照該病人的情況進(jìn)行精細(xì)的調(diào)整，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

Bendall的工作還可能有助于重新定義科學(xué)家如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)�！皞鹘y(tǒng)流式研究往往具有強(qiáng)烈的‘假設(shè)驅(qū)動(dòng)’色彩”他說�！八鼈兺�往是一些‘是或否’的問題，或者是一個(gè)清單。” 但是，當(dāng)你不知道在尋找什么的時(shí)候該怎么辦呢？
在Bendall 2014年四月發(fā)表在Cell上的文章中，他在正常人骨髓中發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞前體的幾個(gè)新的組分，這在此前是沒有報(bào)道過的。一群被稱為“組分三”的B細(xì)胞，起到了“看門人”的角色，決定了B細(xì)胞的成熟并做為一個(gè)“檢查站”防止自身免疫的發(fā)生。這是一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)：

“這些細(xì)胞在骨髓中比率約為萬分之一，”Bendall解釋道，“所以，除非你清楚地知道細(xì)胞的特征是什么，否則你沒有辦法隨機(jī)的找到它們�！�

圖七、2014年Bendall在《cell》中報(bào)道了一個(gè)新的B細(xì)胞前體亞群（Population 3）

CyTOF數(shù)據(jù)能幫助其找出正確的細(xì)胞群，這使Bendall能夠進(jìn)一步進(jìn)行基因組分析，以此證明B細(xì)胞的基因組重排是隨著細(xì)胞發(fā)育過程而增加的。這不僅僅是一個(gè)發(fā)現(xiàn)——它成了一個(gè)全新的策略。它給了Bendall一個(gè)新的工作流程，這就是以這種分階段的方法將基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合起來，并在最后清晰的提煉出他的結(jié)論。

“在一個(gè)細(xì)胞群體中，也許1/3細(xì)胞的2/3是最有趣的，”Bendall提到�！拔也恢�道怎樣區(qū)分這些細(xì)胞，但現(xiàn)在我有一個(gè)基本的概念，我可以預(yù)先提純，使它們進(jìn)入下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在下面的步驟中可以采用諸如基因表達(dá)等其他指標(biāo)更深入的挖掘細(xì)胞內(nèi)的信息。這是不同技術(shù)的結(jié)合，真正實(shí)現(xiàn) “連續(xù)攻擊”。

首先，Bendall 利用CyTOF發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新細(xì)胞群體，然后進(jìn)行mRNA測(cè)序去尋找其獨(dú)特的表面Marker。根據(jù)這些表面Marker，就可以利用傳統(tǒng)流式富集特殊細(xì)胞群體。通過刺激物或藥物處理細(xì)胞，最后通過基因測(cè)序或質(zhì)譜流式來深入研究其生物學(xué)效應(yīng)。

圖八、新的研究策略：質(zhì)譜流式與常規(guī)流式、DNA檢測(cè)等常規(guī)手段的有機(jī)結(jié)合

單細(xì)胞技術(shù)和CyTOF實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)都處于這種分階段研究策略的前沿，它使科學(xué)家們能夠“處理小數(shù)量的樣本同時(shí)，可以提出許多許多問題，”他說。在某種程度上，Bendall和他的同事第一次走在一條返樸歸真的道路上。細(xì)胞是生命的基本單元，當(dāng)你逐個(gè)去觀察它們時(shí)，就可以明白更多。

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