淋巴細(xì)胞的分離和激化實(shí)驗(yàn)介紹

實(shí)驗(yàn)試劑

1. PBS（Dulbecco）：
   0.10g/L 無水CaCl₂
   0.20g/L KCl
   0.20g/L KHPO₄
   0.10g/L MgCl₂.6H₂O
   8.00g/L NaCl
   2.16g/L NaH₂PO₄.7H₂O
   調(diào)pH至7.4

2. 生長(zhǎng)培養(yǎng)基：
   不含谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基
   10% FBS
   慶大霉素（可不用）（10μg/ml）
   2mmol/L L-谷氨酰胺
   1mmol/L 丙酮酸鈉

3. 促細(xì)胞分裂劑（終濃度）
   5μg/ml PHA：1mg/ml母液-20℃分裝凍存
   25μg/ml 刀豆凝集素A（conA）：0.4mg/ml母液-20℃分裝凍存
   商陸促分裂原：再水華母液-20℃分裝凍存

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 收集10ml全血，加入不含防腐劑的肝素（0.2ml肝素/10ml全血）。實(shí)驗(yàn)全過程保持無菌操作。
2. 在15ml離心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖，室溫放置20~30min，沉降紅細(xì)胞。沉降時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則單核細(xì)胞將不再保留在富含白細(xì)胞的血漿。
3. 從葡聚糖處理的血中小心收集紅細(xì)胞上層的富含白細(xì)胞的血漿。
4. 富含白細(xì)胞的血漿室溫300g離心8min，沉淀細(xì)胞。
5. 棄上清，細(xì)胞輕懸于1ml PBS中。
6. 于室溫下，用無菌巴斯德吸管小心將細(xì)胞懸液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技術(shù)熟練，才能保持血漿曾在Ficoll-Hypaque層之間界面清晰。
7. 400g低溫（4℃）離心30min，沉淀細(xì)胞。離心后切記不要破壞管中的分層。
8. 淋巴細(xì)胞在血漿和Ficoll-Hypaque層之間的白色渾濁條帶中，小心取出貯存，棄紅細(xì)胞沉淀。
9. 5ml PBS洗一次細(xì)胞，室溫250g離心5min，沉淀細(xì)胞懸于3~5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
10. 全部細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25組織培養(yǎng)瓶，加促細(xì)胞分裂劑。