具有全新成像模塊和目標(biāo)識別軟件的多功能微孔板檢測系統(tǒng)

 

當(dāng)需獲得高質(zhì)量、多種參數(shù)的數(shù)據(jù)時，我們需要一種能夠進(jìn)行復(fù)雜的基于細(xì)胞學(xué)檢測的儀器來提高數(shù)據(jù)獲取速度。這里我們通過一系列基于細(xì)胞學(xué)檢測的結(jié)果，來介紹一款將細(xì)胞成像系統(tǒng)和多功能微孔板檢測系統(tǒng)整合于一體的儀器，它即能夠提高檢測的通量，也能夠增加檢測數(shù)據(jù)的豐富度。此儀器即為Molecular Devices公司最新推出的SpectraMax® MiniMax™ 300，其標(biāo)配有一個白色透射光通道和兩個熒光檢測通道。其專利的免染料標(biāo)記的細(xì)胞檢測技術(shù)，可通過其白色透射光通道對微孔板內(nèi)沒有標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行精確計數(shù)，幫助分析細(xì)胞增殖、分化和化合物對細(xì)胞的毒性影響等情況。其標(biāo)配的兩個熒光通道大大提高了此儀器的檢測范圍，包括檢測細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力/細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化或者細(xì)胞周期。分析軟件中使用了全新的邏輯運算方式來識別細(xì)胞，可以簡化分析過程并且可輸出更多種參數(shù)數(shù)據(jù)：細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞匯合度、平均和完整的細(xì)胞面積、平均和完整的熒光信號強度。我們列舉了幾種基于細(xì)胞動力學(xué)檢測的實例。我們展示了如何利用全新的細(xì)胞成像系統(tǒng)來更好的服務(wù)于生物學(xué)的研究，基于此平臺的基礎(chǔ)上發(fā)展了幾種即適合生物制藥企業(yè)也適合研究中心的檢測方法。

SpectraMax® MiniMax™ 300細(xì)胞成像系統(tǒng)

·         可結(jié)合SpectraMax® I3多功能微孔板檢測系統(tǒng)；

·         熒光&透射光模塊；

·         簡便的操作來源于其全自動化設(shè)計

·         專有固態(tài)照明

·         高靈敏度的CCD相機(jī)

·         專有的激光自動聚焦方式

·         優(yōu)異均一性&對比度

·         專業(yè)的SoftMax® Pro軟件

 

 

根據(jù)Protocol要求將Hela細(xì)胞種在96孔板中(4000 cell/well)，使用抗癌化合物處理細(xì)胞48小時以后，用MinMax成像系統(tǒng)的透射光通道獲取細(xì)胞圖像，并且在無需染料的情況下，僅通過軟件的邏輯運算功能就可以對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)或得出細(xì)胞覆蓋面積的百分比。使用SoftMax6.4軟件直接獲得IC50值，可在不同時間點進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。

 

使用來自于Cellular Dynamics International(CDI)公司的由ipsc(誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞)分化的肝細(xì)胞，按照其要求種在微孔板中。使用膠原包被的9 6 孔板， 其中細(xì)胞密度為60000 cell/well，或者使用膠原包被的384孔板，其中細(xì)胞密度為15000 cell/well，培養(yǎng)2-3天，然后用相應(yīng)化合物刺激細(xì)胞72小時。使用Calcein(活細(xì)胞檢測試劑盒，Invitrogen)或者使用鬼筆環(huán)肽共軛連接的AF488(固定細(xì)胞，BD試劑盒)染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，使用MinMax成像系統(tǒng)獲得圖像后，利用軟件邏輯運算功能分析細(xì)胞的增殖情況。

 

將造血干細(xì)胞(CD34+細(xì)胞，Lonza)種在96孔板中，然后加入細(xì)胞因子指示劑和抗癌藥物后培養(yǎng)5天。使用Cell Tracker Green(Invitrogen)或抗血型糖蛋白A(anti-Glycophorin A)(BD試劑盒)。成像后的細(xì)胞，使用軟件自帶模塊來分析細(xì)胞的數(shù)目。

 

全新的SpectraMax MinMax 300成像系統(tǒng)可以幫助用戶按照自己的需要輕松設(shè)置試驗，然后快速進(jìn)行檢測。此系統(tǒng)具有強大的獲取、分析圖像的功能， 得益于圖像分析行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)軟件MetaMorph，我們將其核心分析功能整合進(jìn)了SoftMax Pro軟件中。用戶可以根據(jù)自己特定試驗的需求從若干個應(yīng)用模版中進(jìn)行選擇，再去獲取和分析圖像。

 

 

透射光成像功能對于基于細(xì)胞學(xué)檢測的試驗非常具有吸引力，原因在于其無需標(biāo)記，且僅需要較短的曝光時間，不同時間點都可以檢測且對細(xì)胞無損傷。然而，在透射光條件下對許多連接緊密的細(xì)胞進(jìn)行分割是一個非常大的挑戰(zhàn)，因為細(xì)胞與背景的對比度很低，這樣就需要軟件具有強大的邏輯運算能力。這里，我們介紹具有專利的無標(biāo)記細(xì)胞檢測技術(shù)，通過儀器的學(xué)習(xí)能力簡化圖像的分析設(shè)置，它可以適用于很多不同種類的細(xì)胞。

 

 

細(xì)胞增殖/毒性，通過癌細(xì)胞(HeLa)增殖情況來評價抗癌藥物的療效

透射光條件下的無標(biāo)記細(xì)胞計數(shù)功能，進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗可在不同時間點獲得結(jié)果。使得可以選擇不同時間點記錄抗增殖藥物或者生長因子對細(xì)胞的作用效果，繪出濃度效應(yīng)學(xué)曲線并給出IC₅₀s值，而且重要的是整個過程不需要染細(xì)胞進(jìn)行觀察，試驗過程并不會影響細(xì)胞正常變化。

 

 

 

 

肝細(xì)胞毒性分析試驗使用誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(ipsc)分化的肝細(xì)胞作為研究對象。使用若干種肝毒性藥物對這些細(xì)胞處理72小時后，我們使用Calecin或者鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)的AF-488評價細(xì)胞的活力，毒性檢測的評價方法可以根據(jù)細(xì)胞區(qū)域面積變化或細(xì)胞數(shù)目的變化，黃曲霉毒素、十字袍堿、依托泊苷和其他肝毒性化合物的IC₅₀s值的確定，檢測試驗的窗口大約為200，Z值＞0.9。

 

 

我們設(shè)計出一個非常適合檢測生長因子和抗癌藥物對造血作用影響的試驗，我們將造血干細(xì)胞中加入不同的生長因子進(jìn)行培養(yǎng)，此外，可以用來評價幾種抗癌藥物的作用效果，使用標(biāo)記有FITC細(xì)胞系特異性的抗體進(jìn)行染色或者使用細(xì)胞示蹤綠色染料(Cell Tracker Green)。可以用于檢測許多表達(dá)譜系特異性標(biāo)記物的細(xì)胞或全部細(xì)胞數(shù)目，IC₅₀s由不同因素所決定。試驗窗口(assay window)＞100，Z值＞0.7。

 

 

·         不同的細(xì)胞因子組合對CD34+細(xì)胞培養(yǎng)情況影響

·         使用細(xì)胞示蹤綠色染料(Cell Tracker Green)(針對全部細(xì)胞進(jìn)行計數(shù))或A型血糖蛋白(標(biāo)記紅色祖細(xì)胞)

 

 

·         CD34+細(xì)胞培養(yǎng)時加入促紅細(xì)胞生成素(EPO)和抗癌藥物

·         細(xì)胞計數(shù)(擴(kuò)增/毒性)