如何使用SpectraMax® M5 多功能微孔板讀板機(jī)和IMAP® 熒光偏振檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行激酶活性的分析

 

 

蛋白激酶在調(diào)節(jié)許多細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程時(shí)起著核心的作用。近年來(lái)已經(jīng)成為癌癥和其它許多疾病藥物重要的作用靶點(diǎn)。IMA P是Molecular Devices 公司推出一種快速、非放射性的激酶檢測(cè)技術(shù)，由于技術(shù)本身特點(diǎn)其非常適合用于進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化和高通量的篩選。 IMAP檢測(cè)技術(shù)基于的原理是磷酸根離子與表面固化有三價(jià)金屬離子的納米球顆粒的一種結(jié)合作用。當(dāng)這種結(jié)合反應(yīng)發(fā)生后，熒光標(biāo)記的多肽分子的運(yùn)動(dòng)軌跡發(fā)生了改變，熒光標(biāo)記復(fù)合物的熒光偏振值就會(huì)增加(See Figure 1.)。因?yàn)槭且环N均相的，可忽視底物多肽序列的一種檢測(cè)方法，所以可廣泛的應(yīng)用于多種激酶的檢測(cè)。

 

當(dāng)使用 IMAP技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化和高通量的篩選時(shí)，SpectraMax M5多功能微孔板讀板機(jī)可作為其非常理想的、可靠的檢測(cè)平臺(tái)。SpectraMax M5是一種基于光柵型單色器的多功能微孔板讀板機(jī)，允許使用者針對(duì)不同的熒光染料分子隨意選擇不同的檢測(cè)波長(zhǎng)，而無(wú)需額外再選購(gòu)濾光片配件。這篇應(yīng)用文章詳細(xì)的描述了在進(jìn)行IMAP熒光偏振激酶試驗(yàn)時(shí)，如何使用SpectraMax M5多功能微孔板讀板機(jī)和 SoftMax® Pro 軟件進(jìn)行檢測(cè)和分別對(duì)紅色及綠色熒光底物來(lái)校正曲線。LCK是一種酪氨酸酶，在T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著非常關(guān)鍵作用，制備其稀釋曲線。另外Akt1/PKBa，一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，參與磷脂酰肌醇激酶3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞活力。通過(guò)十字孢堿抑制A k t 1 / P K B a 的試驗(yàn)中， 計(jì)算FAM 和TAMRA分別標(biāo)記的多肽底物在反應(yīng)過(guò)程始中獲得的Z'因子值，其結(jié)果與濾光片式多功能微孔板讀板機(jī)上獲得的結(jié)果相一致。

 

IMAP快速篩選試劑盒( Molec ular  Devices Cat. #R8125)

IMAP結(jié)合試劑

IMAP 結(jié)合緩沖液 A (5X)

IMAP結(jié)合緩沖液B (5X)

IMAP反應(yīng)緩沖液（5X）

LCK激酶(Upstate Cat. #14-442)

標(biāo)記FAM - p34cdc 2 多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7157)

標(biāo)記TAMRA - p34cdc 2多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7309)

標(biāo)記FAM-p34cdc2來(lái)源的磷酸化多肽校正試劑(Molecular Devices Cat.#R7271)

貯存在純水中的50 mM Adenosine 5’triphosphate (ATP)(Sigma Cat. #A6559)

貯存在純水中的100 mM DL-Dithiothreitol(DTT)(Sigma Cat. #D9779)

十字孢堿 (Staurosporine) Biomol Cat.#EI-156)

黑色聚苯乙烯材質(zhì)的384孔板(Corning Cat. #3710)

預(yù)裝有SoftMax Pro軟件電腦及連接SpectraMax M5 多功能微孔板讀板機(jī)(Molecular Devices)

 

步驟1.在1xIMAP反應(yīng)緩沖液中加入DTT，并使DTT得終濃度達(dá)到1mM(1:100稀釋100mM的DTT貯存液)，得到完整的反應(yīng)緩沖液(CRB)；

步驟2.在CRB中制備400nM(4x)的FAM或TAMRA標(biāo)記的多肽底物(1:50稀釋原20uM的多肽貯存液)；

步驟3.在CRB中制備20uM(4x)的ATP( 1 : 2 5 0 0稀釋原50mM的ATP貯存液)；

步驟4.準(zhǔn)備一份終濃度為4x的酶梯度稀釋液。對(duì)于激酶抑制劑試驗(yàn)，使用恒定濃度的酶，并制備出一組十字孢堿或其它激酶抑制劑的梯度稀釋液。

步驟5.

將下列試劑平行的加入4個(gè)復(fù)孔的激酶反應(yīng)體系中：

5ul CRB或十字孢堿

5ul酶(對(duì)于沒(méi)有添加酶的背景孔，加入5ul CRB作為替代)

5ul 20uM的ATP貯存液

5ul 400 nM的多肽貯存液

步驟6.室溫孵育1到1.5小時(shí)。

 

步驟1.在CRB中制備一份100nM的多肽貯存液(使用與激酶試驗(yàn)中相同的底物)；

步驟2. 在CRB中制備一份100nM的磷酸多肽貯存液(使用與激酶試驗(yàn)中相同的磷酸化底物)；

步驟3.如圖表1所示將多肽和磷酸化多肽貯存液按照一定規(guī)律混合后，制備校正標(biāo)準(zhǔn)品。樣品量足夠4個(gè)復(fù)孔所需；

步驟4.各移出20ul校正標(biāo)準(zhǔn)品到4個(gè)復(fù)孔中，包括一組只有20ul CRB的空白背景樣本。

 

 

 

步驟1.將75%的結(jié)合緩沖液A與25%的結(jié)合緩沖液B混合，制備結(jié)合緩沖液；

步驟2.將結(jié)合試劑以1:600倍稀釋成結(jié)合緩沖液，得到結(jié)合反應(yīng)液；

步驟3.移出60ul結(jié)合反應(yīng)液到每個(gè)檢測(cè)孔和校正標(biāo)準(zhǔn)孔中(包括背景孔樣本)

步驟4.室溫避光孵育1小時(shí)

 

在SoftMax Pro軟件上設(shè)置模板，并在SpectraMax M5多功能微孔板讀板機(jī)上進(jìn)行讀數(shù)

Note：FAM和TAMRA標(biāo)記底物的IMAP熒光偏正實(shí)驗(yàn)的模板在SoftMax Pro 5 軟件上已預(yù)設(shè)好，詳見(jiàn)Binding Assays模板文件夾。

 

步驟1.打開(kāi)SoftMax Pro軟件上針對(duì)熒光素使用的IMAP 熒光偏振模板。FAM和TAMRA模板已預(yù)設(shè)好；如果使用的不是FAM和TAMRA熒光素，只需調(diào)整波長(zhǎng)設(shè)置即可。對(duì)于SpectraMax M5多功能微孔板讀板機(jī)上的參數(shù)設(shè)置（見(jiàn)圖表2）。

 

 

步驟2.設(shè)置一個(gè)試驗(yàn)?zāi)０�，選定背景樣品本孔、激酶樣品本孔、校正標(biāo)準(zhǔn)品孔。激酶試驗(yàn)樣品和校正標(biāo)準(zhǔn)品可分到SoftMax Pro軟件模板上預(yù)設(shè)好的8個(gè)樣本組中。在計(jì)算最小偏振值（mP）之前，首先將只含有緩沖液的質(zhì)控品分到相應(yīng)的背景組中后，使用軟件自動(dòng)扣除其背景熒光值。

 

 

 

 

 

步驟3.把微孔板放到讀板機(jī)里后---確保紫色托架（適配器）放置在微孔板托架上---然后點(diǎn)擊Read讀板。

 

SoftMax Pro軟件中預(yù)置的IMAP 熒光偏振模板會(huì)自動(dòng)計(jì)算出水平偏振均值和垂直偏振均值(mP值)，總的熒光強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)方差和CV值。每一組試驗(yàn)樣品的組群一欄中，模板會(huì)自動(dòng)扣除背景樣品的熒光偏振值，然后計(jì)算出最小偏振mP值。也可根據(jù)相應(yīng)的校正曲線計(jì)算出樣品磷酸化比率。(See IMAP Application Note #4, “Developing calibration curves for IMAP”)

 

圖表2顯示了使用 FAM-p34cdc2多肽獲得的一條LCK激酶的稀釋度曲線。當(dāng)用SpectraMax M5微孔板讀板機(jī)檢測(cè)時(shí)，得出酶的濃度范圍從0.04至3.5 units/ml，最小偏振值為303，同時(shí)Z'因子的值為0.87。圖表3顯示了使用Analyst HT多功能讀微孔板讀板機(jī)檢測(cè)相同孔時(shí)，熒光偏振值為336，Z'因子的值為0.95。兩臺(tái)儀器得到的EC50值均為0.5 units/ml。

 

如果使用非磷酸化和磷酸化的多肽樣品作為質(zhì)控分別做一條校正曲線，可以將熒光偏振值以百分比形式顯示，得出其磷酸化程度。(See Figure 4.)首先建立一條新的曲線(軟件默認(rèn)名稱(chēng)為Graph#1)，分別使用熒光偏振值(mP值)相對(duì)磷酸化百分比(濃度)作為你的質(zhì)控樣品組繪制一條曲線。曲線默認(rèn)名稱(chēng)為“Plot#1.”在校正標(biāo)準(zhǔn)品組欄里，新建一列后輸入下面的公式，即：

InterpX(‘Plot#1@ Graph#1@IMAP FP_FAM’,AvgbkgsubmP)。并用‘IMAP FP_FAM’作為試驗(yàn)名稱(chēng)。

 

為了確定使用紅色熒光染料進(jìn)行IMAP激酶試驗(yàn)的效果，另一個(gè)LCK激酶稀釋曲線結(jié)果的獲得來(lái)源于TAMRA-p34cdc2多肽。(See Figure 5.)使用SpectraMax M5微孔板讀板機(jī)檢測(cè)結(jié)果，酶的濃度范圍是從0.04到3.5 units/ml，熒光偏振值(mP值)為258 ， 同時(shí)Z ' 因子的值為0.95 。在Figure 6中，相同的試驗(yàn)使用Analyst HT微孔板讀板機(jī)進(jìn)行檢測(cè)后，熒光偏振值(mP值)結(jié)果為270，同時(shí)Z'因子的值為0.93。兩個(gè)讀板機(jī)得到的EC50值都為0.4units/ml，與FAM標(biāo)記的底物獲得結(jié)果相一致。同樣也建立了一條相關(guān)的校正曲線(See Figure 7.)，TAMRA和FAM相近的結(jié)果也可以讓用戶(hù)利用紅色熒光染料給我們帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)，即能夠盡可能降低化合物產(chǎn)生的背景熒光。

 

 

隨著研究人員努力去探究激酶在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和各種疾病中扮演的角色，以及在許多疾病治療中發(fā)揮的調(diào)節(jié)機(jī)制，他們?cè)絹?lái)越希望獲得非放射性的、均相的檢測(cè)方法，可用于試驗(yàn)優(yōu)化和高通量藥物的篩選。熒光偏振試驗(yàn)可提供一種均相的、高通量的方式來(lái)鑒定各種激酶的激活劑、抑制劑和底物。使用SpectraMax M5多功能微孔板讀板機(jī)進(jìn)行IMAP熒光偏振檢測(cè)：獲得的結(jié)果精確性高、重復(fù)好、Z'因子值高，雙光柵型單色器系統(tǒng)方便使用者選擇不同熒光染料標(biāo)記的多肽底物進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，而無(wú)需額外的在選購(gòu)濾光片。此外，無(wú)論是用綠色或者紅色熒光染料標(biāo)記的底物進(jìn)行IMAP熒光偏振激酶試驗(yàn)，獲得的結(jié)果都與使用濾光片型單色器的微孔板讀板機(jī)上的檢測(cè)值相一致。最后，SoftMax Pro軟件上預(yù)設(shè)的IMAP 熒光偏振模板為熒光偏振數(shù)據(jù)的采集和分析提供了一種更為方便的方式，并且這些模板也可用于不同熒光染料分子的檢測(cè)。

 

1.IMAP Akt Assay Kit Product Insert(Molecular Devices product #R8058).

2.Developing calibration curves for IMAP(IMAP Application Note #4).

3.Zhang, J.H., Chung, T.D.Y., and Oldenburg,K.R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthroughput screening assays. J Biomol Screen 4 (2): 67-73.