用DNA 芯片技術(shù)檢測(cè)基因的表達(dá)介紹

二、靶基因樣品的制備

與普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一樣，靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和標(biāo)記�；�因芯片包括大量探針分子，因此，靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對(duì)象(如mRNA 、DNA等)而決定。對(duì)于大多數(shù)基因來(lái)說(shuō)，mRNA 的表達(dá)水平大致與其蛋白質(zhì)的水平相對(duì)應(yīng)，因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)對(duì)于了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)十分重要。用基因芯片可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量基因的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，其靶基因的制備一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

待測(cè)樣品的標(biāo)記，主要采用熒光分子。常規(guī)標(biāo)記的過(guò)程是通過(guò)在擴(kuò)增過(guò)程中加入含有熒光標(biāo)記的dNTP（至少一種為熒光標(biāo)記的），熒光標(biāo)記的單核苷酸分子，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進(jìn)行分子雜交。也可采用末端標(biāo)記法，直接在引物上標(biāo)記熒光。即在引物合成時(shí)通過(guò)應(yīng)用熒光標(biāo)記的dNTP制備熒光標(biāo)記引物，或通過(guò)標(biāo)記生物素，進(jìn)行熒光標(biāo)記。

對(duì)于陣列密度較小的基因芯片(經(jīng)常用膜片作為基底)可以用同位素檢測(cè)法，采用³²P標(biāo)記技術(shù)，這樣可以運(yùn)用現(xiàn)在普通使用的同位素顯影技術(shù)和儀器。但是，在使用同位素靶基因標(biāo)記法過(guò)程中，一些表達(dá)量高雜交信號(hào)強(qiáng)的點(diǎn)陣，容易在其周圍產(chǎn)生光暈，當(dāng)其周圍點(diǎn)陣的雜交信號(hào)較弱時(shí)，其雜交信號(hào)容易受到強(qiáng)雜交信號(hào)的掩蓋。 
 

三、靶基因的雜交及其信號(hào)的檢測(cè)

cDNA基因芯片與靶基因的雜交過(guò)程與一般常規(guī)的分子雜交過(guò)程基本相同。在基因芯片的雜交檢測(cè)中，為了更好的比較不同來(lái)源樣品的基因表達(dá)差異，或者為了提高基因芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和測(cè)量范圍，通常使用多色熒光技術(shù)。即把不同來(lái)源的靶基因用不同激發(fā)波長(zhǎng)的的熒光探針來(lái)修飾，并同時(shí)使它們與基因芯片雜交。通過(guò)比較芯片上不同波長(zhǎng)熒光的分布圖，可以直接獲得不同樣品中基因表達(dá)的差異。

人們還發(fā)展了其它靈敏度高、特異性好的基因芯片雜交檢測(cè)方法。例如短序列偶聯(lián)法。該方法首先將非標(biāo)記的DNA靶序列與基因芯片上探針陣列進(jìn)行完全雜交，若基因芯片上探針的固定端是5’端時(shí)，繼續(xù)以靶基因?yàn)槟０�，可以在暴露于溶液中�?’-OH上用DNA聚合酶合成上新的帶有熒光標(biāo)記的堿基（ddNTPs）。通過(guò)檢測(cè)ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 

美國(guó)Nanogen公司提出了一種通過(guò)交變電場(chǎng)加速基因芯片的雜交速度的主動(dòng)式基因芯片。他們利用核酸分子所帶的負(fù)電性質(zhì)，通過(guò)快速反轉(zhuǎn)電場(chǎng)的極性，使靶基因與探針間產(chǎn)生快速結(jié)合和分離。通過(guò)控制電場(chǎng)的大小，使得完全匹配雜交的核酸分子保留在陣列表面，而非特異性結(jié)合的DNA在電場(chǎng)的作用下與探針分離。這種芯片的分子雜交速度可縮短至1分鐘以下甚至數(shù)秒（cheng et al，1998），因此有較廣闊的應(yīng)用前景。