細(xì)胞凋亡檢測方法介紹

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在生長到一定階段及某些生理過程中，會受到多因素和機制的嚴(yán)格調(diào)控而進(jìn)入死亡。這是一個動態(tài)的過程,會涉及一系列復(fù)雜的生化反應(yīng), 是一個需要酶參與的級聯(lián)反應(yīng),同時也涉及不同基因的表達(dá)及調(diào)控、信號傳導(dǎo)。其中有幾項生理過程能被用來檢測凋亡的發(fā)生，因此多參數(shù)分析法對于準(zhǔn)確檢測這一過程十分重要。同時，了解細(xì)胞死亡和存活機制也是毒理分析和藥物研發(fā)應(yīng)用中一個非常關(guān)鍵的內(nèi)容。 Sigma®聯(lián)合Roche®提供多種分析細(xì)胞凋亡的研究方法。包括：Caspase活性檢測；DNA片段化分析和檢測；膜變化檢測（AnnexinV染色、膜電位、線粒體功能完整性分析檢測實驗）及細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測。

Caspase活性檢測

Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases)是一個家族的蛋白酶，它的活化是細(xì)胞凋亡的典型特征。一旦一個Caspase 酶被激發(fā)，就會激活一系列其他的Caspas酶,裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase 3 活化發(fā)生在凋亡早期，并在凋亡過程中起重要作用。Caspase 3 Activity Assay (CASP3C) 基于熒光免疫酶測定，能在體外特異性地對Caspase 3進(jìn)行定量。

膜變化檢測

凋亡細(xì)胞另一個生化特征是細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸從胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞外。膜聯(lián)蛋白中的Annexin V，是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有強親和力。通過使用Annexin V FLUOS Staining Kit (11988549001) 或Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (APOAF) 方法進(jìn)行凋亡細(xì)胞早期檢測�？墒褂昧魇郊�(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測。同時使用PI，根據(jù)細(xì)胞膜的通透性區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。 線粒體膜電位和膜通透性的變化也是凋亡細(xì)胞一個重要特點。可使用Cytochrome c Oxidase Assay Kit (CYTOCOX1) 試劑盒檢測凋亡細(xì)胞線粒體所釋放的細(xì)胞色素C。也可使用Mitochondria Isolation Kit 1 (MITOISO1) 分離凋亡細(xì)胞線粒體，其膜電位可通過Mitochondrion Membrane Potential Kit (MAK146-1KT) 檢測。

DNA片段化分析

DNA降解也是細(xì)胞凋亡的典型標(biāo)志之一,其降解產(chǎn)物可分為兩種，即高分子量的單鏈DNA缺口以及低分子量DNA片斷(單鏈及寡聚核小體)。單鏈DNA缺口有特定的檢測方法，即利用酶催化，將特定核酸標(biāo)記到游離的3'-OH末端，這種方法被稱為 TUNEL。Roche提供的基于TUNEL法的In Situ Cell Death Kit, fluorescein （11684795910）能夠在組織及單細(xì)胞中檢測到低水平的凋亡，靈敏度高，背景干擾小，且可通過后續(xù)的流式、熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡檢測對細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量。 在凋亡細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)的組蛋白聯(lián)合的DNA片斷(單鏈及寡聚小體)，可使用Cell Death Detection ELISAPLUS（11774425001）高通量地檢測細(xì)胞死亡，或使用Apoptotic DNA-Ladder Kit （11835246001）通過純化及瓊脂糖電泳分析這些呈現(xiàn)出典型的ladder狀態(tài)的DNA片斷。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測

細(xì)胞形態(tài)的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質(zhì)致密、胞質(zhì)濃縮等，都可作為細(xì)胞凋亡的證據(jù)。一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342 (B2261)，Hoechst 33258 (B2883), DAPI (D9542)。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。