轉(zhuǎn)基因食品的檢測

         楊云霞 1  蔣士強2  趙明1  董志強1

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因食品 轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品 食品安全 生物技術(shù) 檢測技術(shù)

Abstract:  discuss on the question Genetically modified crops and Genetically modified food safety are discussed. The method of detection from gene and gene translation and gene express is given.
      Key words: Genetically modified crops   Genetically modified food  food Safety   biotechnology  Detection technology

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展、基因工程技術(shù)已在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛運用。自二十世紀八十年代以來以基因改良為核心的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)正掀起第二次綠色革命。運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Gene transfer）能培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲害、抗逆的優(yōu)良品種，以緩解由于人口迅速增長、可耕地的減少、資源短缺、環(huán)境惡化而帶來的農(nóng)牧產(chǎn)品和食品短缺的危機。以農(nóng)作物為例〔1〕自1994年第一例轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿在美國批準上市以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積迅猛擴大，由1996年的170萬公頃增長到2002年的5870萬公頃。轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的全球銷售額由1995年的0.75億美元、1999年激增到21～23億美元,預(yù)測2005年將達到80億美元，2010年將突破250億美元〔2〕。

轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品的安全性問題

1.轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品引發(fā)的安全性思考

隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品的迅猛增加，雖然其具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等諸多優(yōu)點，但由于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品和食品是把一種外源基因片斷轉(zhuǎn)移到目的物種中，從而改變目的物種的性狀，特別是1998年發(fā)生的英國蘇格蘭Rowett研究所的Pusztai事件，雖后來被否定〔3〕，但接著1999年又發(fā)生的美國康奈爾大學Losey等報道的帝王蝶〔4〕事件至今尚在進一步驗證之中。而巴西堅果蛋白質(zhì)與其轉(zhuǎn)基因大豆對人引起類似的過敏反應(yīng)等事件，使人們對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品的安全性提出眾多質(zhì)疑，例如：外源基因是否安全? 基因結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定且會不會產(chǎn)生有害人體健康的突變?基因轉(zhuǎn)入后是否產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利健康成分? 營養(yǎng)成分和其它功能性是否改變？轉(zhuǎn)基因的標記基因是否會使人產(chǎn)生抗藥基因? 是否會增加食物的過敏源〔5〕……消費者從自身健康考慮，提出轉(zhuǎn)基因食品安全問題是非常自然的。轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題，已引發(fā)全球爭論，對轉(zhuǎn)基因食品這一新生事物做好安全性檢測和評估是非常必要的。 安全性評估主要包括有無毒性、有無過敏性以及抗生素抗性等標記基因的安全性。世界各國人們都在呼吁對轉(zhuǎn)基因食品進行科學的評估。

2. 實質(zhì)等同性原則〔6〕

目前對食品安全性的評估均采用世界經(jīng)濟發(fā)展合作組織（OECD）1993年提出的實質(zhì)等同性原則，即通過生物技術(shù)得到的轉(zhuǎn)基因食品是否與目前市售常規(guī)食品有實質(zhì)性的等同：⑴生物技術(shù)食品與傳統(tǒng)食品有實質(zhì)性等同。由于經(jīng)過了長期的自然選擇，機體已經(jīng)對該種物質(zhì)具有了良好的適應(yīng)性，人類和自然環(huán)境對其也已經(jīng)接受，對此類產(chǎn)品可不必進行安全檢測與評估。⑵轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品除某一插入的特定性狀外，與非轉(zhuǎn)基因動植物具有實質(zhì)等同性。對這類轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測應(yīng)主要集中在對插入基因表達產(chǎn)物的檢測上，不必過分強調(diào)分析其他性狀，也不必考慮DNA和mRNA本身是否有毒性，因為所有生物體的DNA構(gòu)件元素都是一樣的。⑶轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品沒有實質(zhì)的等同性且市場上沒有與轉(zhuǎn)基因食品相對應(yīng)的傳統(tǒng)產(chǎn)品，對該類產(chǎn)品則要求進行詳細的安全性檢測和評估，包括有無天然有毒物質(zhì)、有無營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子、有無過敏源、轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性和插入突變、基因的多效性和次級效應(yīng)等。

3. 世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的認識和態(tài)度

美國是轉(zhuǎn)基因食品的積極倡導(dǎo)者，美國公民對轉(zhuǎn)基因食品采取比較寬容的態(tài)度，其轉(zhuǎn)基因作物的播種面積一直占據(jù)全世界的首位。他們認為轉(zhuǎn)基因食品在上市之前要經(jīng)過嚴格的市場準入檢測，在實質(zhì)上和傳統(tǒng)的食品沒有什么區(qū)別即可上市。美國由FDA、EPA、USDA負責轉(zhuǎn)基因食品的評價、檢測和監(jiān)控。這些機構(gòu)與聯(lián)合國糧食組織（FAD）、世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國國家科學院（NAS）對新食品管理的原則是一致的〔7〕。

歐盟對轉(zhuǎn)基因食品持比較謹慎的態(tài)度，政府反對美國轉(zhuǎn)基因食品涌入自己的國家。他們認為轉(zhuǎn)基因食品通過生物技術(shù)將其他動物、植物、微生物的一段異源基因不定點插入目的食品，打破生物種間的界限會破壞自然的食品構(gòu)成體系，造成基因水平的混亂，可能會導(dǎo)致一些遺傳學或營養(yǎng)成分的非預(yù)期改變，從而危害人們的健康。同時也認為轉(zhuǎn)基因食品的新組合和性狀在不同遺傳背景下表達，人們還缺乏其對環(huán)境、人類影響的認識，加之應(yīng)用于生產(chǎn)和消費的時間還很短，不能拿出足夠的證據(jù)來證明轉(zhuǎn)基因食品對人的身體是完全安全的。但其中也不乏帶有政治色彩的屬于貿(mào)易壁壘的抵制。歐盟1996年制定的食品標簽法規(guī)規(guī)定必須對轉(zhuǎn)基因食品進行標簽標注。在管理上分橫向的與技術(shù)相關(guān)的法規(guī)和縱向的與產(chǎn)品相關(guān)的法規(guī)〔8〕。

中東一些國家由于宗教的影響從社會倫理方面考慮對轉(zhuǎn)基因食品比較排斥。南美、日本、韓國等屬于比較中立的國家對轉(zhuǎn)基因食品不像歐盟那樣排斥也不像美國那樣認可，他們都開始了轉(zhuǎn)基因食品安全性的試驗研究。我國既積極支持轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究同時對對轉(zhuǎn)基因食品采取比較謹慎的態(tài)度，認同國際上通行的轉(zhuǎn)基因食品的實質(zhì)等同性原則。我國國家科委1993年頒布了《基因工程安全辦法》，1996年農(nóng)業(yè)部正式實施《農(nóng)業(yè)生物基因工程安全性管理法規(guī)》，對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品從試驗研究、中間試驗、環(huán)境釋放到最后的商品化全過程進行安全性評價、并制定了相應(yīng)的監(jiān)督檢測措施。2002年3月，正式實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》。這些政策和法規(guī)的頒布與實施對人們食用轉(zhuǎn)基因食品提供了有力的保障�！�9〕

轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法

鑒于全世界對轉(zhuǎn)基因食品的安全性引起的關(guān)注和激烈爭論，對轉(zhuǎn)基因食品的檢測顯得尤為重要�；�因工程技術(shù)是將克隆的外源基因通過基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等方法轉(zhuǎn)入目的農(nóng)作物中、使目的農(nóng)作物中具有外源基因所具有的優(yōu)良性狀。對轉(zhuǎn)基因食品的檢測、從轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身來分析、可從基因水平、基因轉(zhuǎn)錄水平和基因翻譯產(chǎn)物水平進行。

1. 基因水平的檢測

轉(zhuǎn)基因技術(shù)將從各種生物中克隆出來的目的基因片斷插入到靶向受體中時，一般要構(gòu)建啟動子、終止子、選擇標記基因、報告基因等。從基因水平進行轉(zhuǎn)基因的檢測就是要檢測受體的核酸序列、目的片斷的整合位點、基因多態(tài)性、目的片斷的含量分析以及啟動子、終止子、選擇標記基因、報告基因等。

聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction） PCR法〔10〕

對報檢的樣品運用PCR儀，針對外源基因設(shè)計合適的引物，通過TaqDNA酶的聚合快速特異地擴增目的基因片段，使目的基因片斷以數(shù)量級速度在體外得到擴增從而可以在短短的幾小時內(nèi)使Pg水平的特異外源DNA片段擴增到ng乃至ug水平，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酞胺凝膠電泳，用溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下就可觀察到外源目的片斷。

(1) 定性PCR法

定性PCR可直接檢測啟動子、終止子、標記基因片斷、目的基因片斷。為使目的基因很好的進行表達，在構(gòu)建基因表達載體時常在目的基因的5’和3’端分別加上啟動子和終止子。當前大約75%的轉(zhuǎn)基因植物中使用Ca MV( Cauliflower mosaicvirus) 3 5 S啟動子，其次是胭脂堿和章魚堿合成酶的NOS啟動子和Ocs啟動子。常用的終止子是胭脂堿合成酶的NOS終止子和Rubisco小亞基基因的3’端區(qū)域、所以當前對啟動子和終止子的檢測實際上是對Ca MV35S啟動子和NOS終止子的檢測。然而一些植物如十字花科植物易被CaMV感染而攜帶35S，故檢測出陽性信號;而NOS終止子來源于普遍存在的農(nóng)桿菌(Agrobacterium tume faciens )，因此，用PCR對35S啟動子和NOS終止子進行檢測時應(yīng)配合其他檢測。定性PCR受DNA抽提和純化的影響，如果DNA降解或受污染，檢測結(jié)果就會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；只能初步確定是否為GMF但不能鑒定是哪種GMF。

(2) 定量PCR法

在實際貿(mào)易和食品消費中我們不僅想知道食品是否是轉(zhuǎn)基因的，而且還想知道其中外源基因的含量，即外源基因占GMF的百分含量。在普通的定性PCR擴增過程中，以不同濃度標準陽性樣品作參照，標準陽性物用基因工程方法合成，上游引用熒光標記，下游引物不標記，在模板擴增的同時，標準陽性物也被擴增。。最后根據(jù)吸光值作出吸光值與轉(zhuǎn)基因含量的標準曲線圖，以此可以確定檢測樣品的轉(zhuǎn)基因含量，這樣可以進行半定量檢測。

(3) 定量競爭性 QC一PCR法(Quantitative competitive PCR) 

在PCR的反應(yīng)管中，同時放入用人工合成用熒光標記的模板和待測樣品讓兩者對同一引物同時擴增，反應(yīng)完成后通過測定熒光強度推測待測樣品的DNA含量。

(4) 實時定量熒光PCR法〔11〕

實時定量熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加一條熒光標記基因探針（一般為Taq man）。一個標記在探針的5'端，一個標記在探針的3'端，兩者構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，兩個熒光集團根據(jù)距離控制是吸收或抑制，在PCR不斷擴增中不斷檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化，通過記錄循環(huán)次數(shù)和PCR體系中起始DNA量的對數(shù)值之間的線性關(guān)系確定起始DNA的量。用實時定量熒光PCR對轉(zhuǎn)基因食品進行檢測可避免普通PCR反應(yīng)過程中由于外界污染或樣品本身DNA降解等原因造成的假陽性結(jié)果，但是實時定量熒光PCR儀價格昂貴，檢測費用高。

(5)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR法

 反轉(zhuǎn)錄PCR克服了待檢樣品中外源基因含量特別微量，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過PCR擴增進行檢測。

(6) PCR—ELISA法

PCR一ELISA是I種將PCR高效性與ELISA高特異性結(jié)合在一起的轉(zhuǎn)基因檢測方法。利用共價交聯(lián)在PCR管壁上的寡核普酸作為固相引物，在Taq酶作用下，以目標核酸為模板進行擴增，產(chǎn)物一部分交聯(lián)在管壁上，為固相產(chǎn)物，一部分游離于液體中，為液相產(chǎn)物。對于固相產(chǎn)物，可用標記探針與之雜交，再用堿性磷酸酷酶標記的鏈親和素進行ELISA檢測，同時可通過凝膠電泳對液相產(chǎn)物進行分析。將PCR和ELISA兩種方法相結(jié)合，可以相互取長補短，使檢測的準確性大大提高。目前在我國尚未建立統(tǒng)一完備的轉(zhuǎn)基因食品的篩選方法，隨著轉(zhuǎn)基因食品的數(shù)量增多及我國加入世界貿(mào)易組織，在我國建立轉(zhuǎn)基因食品的篩選方法將對人群健康及生態(tài)環(huán)境的保護起積極的作用。

Southern雜交

Southern雜交技術(shù)在分子生物學中用于基因組DNA特定序列定位。在轉(zhuǎn)基因食品中用Southern技術(shù)，是要在知道該轉(zhuǎn)基因食品轉(zhuǎn)入外源基因片斷的情況下使用。以放射性或熒光標記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農(nóng)產(chǎn)品的總DNA進行雜交。首先用限制酶消化受體總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持體上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過程中，各個DNA片斷的相對位置保持不變，用放射性或熒光標記的探針與各個DNA片斷雜交，經(jīng)放射自顯影確定與探針互補的電泳條帶的位置。Southern技術(shù)用于食品外源基因的檢測可檢測出外源基因與內(nèi)源基因有高度同源性的DNA片斷，且準確可靠，但對樣品的純度要求較高，費用也較高。

基因芯片

基因芯片〔12〕是20世紀80年代末在生命科學領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列的矩陣，基因芯片可以將目前通用的報告基因、抗性基因、啟動子和終止子的特異片段(靶片段)固定于玻片上制成檢測芯片，將從待檢樣品中提取的DNA擴增、標記后與芯片進行雜交，雜交信號由芯片掃描儀檢測，再經(jīng)計算機軟件進行分析判斷,其基本原理為通過雜交檢測信號。基因芯片技術(shù)可對樣品進行集約化和平行處理。利用基因芯片可實現(xiàn)對DNA的準確、快速、大信息量的檢測。從而方便、快速地對大量待檢測轉(zhuǎn)基因作物進行靈敏、準確的檢測。        

其不足之處是每種檢測樣品首先必須有與之相配的非轉(zhuǎn)基因作物的芯片。

 2. 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

northern印跡雜交

將northern技術(shù)用于外源基因的測定可測定特定外源基因DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA分子的大小和豐度。RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中按其大小不同而相互分開，隨后將RNA轉(zhuǎn)移至活化纖維素、硝酸纖維素濾膜上。用放射性標記的外源DNA探針或RNA探針進行雜交和放射自顯影，確定外源DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA。

3. 基因翻譯表達水平的檢測

1. 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(EL ISA)技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(E nzy me一Linked Immunosorbent Assay, EL ISA)用于檢測表達的目的蛋白，其基本原理是抗原抗體的特異性結(jié)合和酶對底物的高效催化。將針對目的蛋白的抗體包被在ELISA板上，加入待測物的溶液，經(jīng)保溫如待測物中含有轉(zhuǎn)基因片斷的表達產(chǎn)物即相應(yīng)的蛋白，該蛋白作為抗原與包被的特異性抗體相結(jié)合。加入酶標記的針對目的蛋白的抗體，再經(jīng)保溫后加入酶反應(yīng)底物顯色，以酶聯(lián)閱讀儀測定OD值。

2. 蛋白芯片

蛋白芯片的操作過程和基因芯片是一樣的，只是其原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合而不是堿基對的互補雜交。

3. Westertern印跡法

Western印跡法的原理和Southern雜交、northern印跡雜交的原理相似，是抗原抗體的特異性結(jié)合。把從樣品中提取的蛋白質(zhì)用凝膠電泳分離成大小不同的分子作為抗原，并將其轉(zhuǎn)移到固體支持物上，用含有放射性標記的抗體做探針與之雜交，通過放射性自顯影檢測外源基因的表達產(chǎn)物。Western印跡法與EL ISA所用都是抗原抗體的特異性結(jié)合，標記探針不同而已。一個為放射性標記，一個為酶標記。

轉(zhuǎn)基因食品檢測的發(fā)展方向和趨勢

由于轉(zhuǎn)基因食品直接關(guān)系到人們的身體健康和切身利益，所以對轉(zhuǎn)基因食品的檢測要求快速、準確、實用、操作簡便。轉(zhuǎn)基因食品的檢測正朝著試劑盒的方向發(fā)展，DNA芯片技術(shù)在未來的轉(zhuǎn)基因檢測中的作用也越來越突出。


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