高架十字迷宮實驗相關-復方抗焦慮膠囊對急性應激大鼠的抗焦慮作用

復方抗焦慮膠囊對急性應激大鼠的抗焦慮作用及對大鼠腦內ERK/CREB信號通路和BDNF表達的影響

摘要:目的研究復方抗焦慮膠囊對急性應激大鼠的藥效及其對大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號通路、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的影響。方法采用高架十字迷宮實驗,觀察了復方抗焦慮膠囊低、中、高劑量(0．75、1．5、3g·kg-1)給藥7d對急性應激大鼠行為的影響,采用Westernblot免疫印跡法研究復方抗焦慮膠囊對ERK/CREB信號通路的影響,對急性應激大鼠腦皮層及海馬BDNF表達的影響。結果高架十字迷宮實驗顯示,復方抗焦慮膠囊高劑量組可明顯增加大鼠進入開臂時間的百分數(OT%)(P<0．05)和進入開臂次數的百分數(OE%)(P<0．05)。Westernblot實驗顯示,復方抗焦慮膠囊中劑量組明顯減少了海馬中p-ERK1/2的表達(P<0．05);高劑量組明顯減少了大鼠皮層和海馬中p-ERK1/2和p-CREB的表達(P<0．05)。高劑量組明顯增加了大鼠皮層及海馬中BDNF的表達水平(P<0．05,P<0．01)。結論復方抗焦慮膠囊在高架十字迷宮模型中具有抗焦慮作用,且其抗焦慮機制可能與影響ERK/CREB信號通路,增加BDNF表達有關系。

關鍵詞:復方抗焦慮膠囊;急性應激;高架十字迷宮;ERK/CREB信號通路;腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF);Westernblot免疫印跡法

焦慮癥是中樞神經系統常見的精神疾病,成為日益增長的全球健康問題。焦慮癥以急性焦慮反復發(fā)作為特征,臨床表現為廣泛性焦慮和發(fā)作性驚恐狀態(tài)2種形式。臨床上以恐懼、緊張不安等精神障礙為主要表現,并伴有心悸、多汗、胸悶、呼吸窘迫以及睡眠障礙等。在精神障礙中,焦慮癥的終生患病率最高,影響到30%人口的壽命。在我國,焦慮癥已成為現代常見病和多發(fā)病,嚴重影響了人們的生活質量。因此,焦慮癥的有效治療成為亟待解決的問題。

苯二氮卓類藥物已被證明是有效的抗焦慮藥,如地西泮等,但這些化合物存在明顯的副作用,如鎮(zhèn)靜、肌肉松弛、遺忘和依賴性。并且抗焦慮藥物的服藥時程長,易導致戒斷反應、反跳和依賴。臨床證實,中藥治療焦慮癥不僅安全有效、副作用小,還具有改善其它相關癥狀的作用。因此,研究開發(fā)療效好、副作用小的中藥抗焦慮新藥成為近些年來研究的熱點。

復方抗焦慮膠囊(antianxieticcompoundprescriptioncapsule,ACPC)來源于臨床經驗方,由蜘蛛香、合歡皮、炒酸棗仁、燈心草組成,功能理氣解郁、養(yǎng)血安神,主要治療肝郁氣滯、心神不寧型焦慮癥。前期研究表明,該復方具有穩(wěn)定的抗焦慮作用,且不影響動物的自主行為活動,其作用機制與調節(jié)GABAA受體[9-10]、Cdk5/p35通路的表達,抑制腦中單胺類神經遞質的釋放以及調節(jié)免疫功能紊亂相關。為了更加深入地對復方抗焦慮膠囊的藥效進行評價,明確其作用特點,為其安全有效的應用提供實驗和理論依據,本實驗探討了復方抗焦慮膠囊對急性應激大鼠的作用及其機制。

1材料

1.1動物SPF級SD♂大鼠,體質量150~170g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)(2012-0001)。

1.2藥品與試劑①蜘蛛香藥材購自云南省師宗縣,炒酸棗仁、合歡皮和燈心草購于河北省安國市藺氏有限責任公司,經北京中醫(yī)藥大學石晉麗教授鑒定,蜘蛛香為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖及根;酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥種子;合歡皮為豆科植物合歡AlbizziajulibrissinDurazz.的樹皮;燈心草為燈心草科植物燈心草JuncuseffusesL.的干燥莖髓。蜘蛛香、炒酸棗仁、合歡皮、燈心草(均為干浸膏)按照12∶9∶9∶1的質量比混合,再加入0.5倍干膏量的糊精混勻,制成顆粒,干燥,分裝,即得復方抗焦慮膠囊(含橙皮苷1．05mg·g-1、酸棗仁皂苷A7.50mg·g-1),實驗前用氯化鈉注射液將其制成溶液備用。②地西泮(diazepam,DZP),2．5mg×20片,國藥準字H11020898,北京益民藥業(yè)有限公司,批號20120305。③氯化鈉注射液,國藥準字H37020764,山東齊都藥業(yè)有限公司,批號1012081004。④RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺、膜再生液、封閉用脫脂奶粉均購自北京普利萊生物科技有限公司;過硫酸銨(ammoniumpersulphate,AP)為美國Amersco公司產品;甲叉雙丙稀酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)為美國Sigma公司產品;三氨基甲烷(Tris)、甘氨酸購自美國Novon公司;p-ERK1/2、ERK1/2、pCREB和CREB抗體為CellSignaling公司產品;β-actin單克隆抗體為SantaCruz公司產品;HRP標記山羊抗兔及兔抗山羊二抗均為中杉金橋公司產品;ECL發(fā)光檢測試劑盒及光譜彩虹預染蛋白Marker均為康為公司產品;PVDF膜為美國Millipore公司產品;其它試劑為國產分析純。

1.3儀器

1.3.1高架十字迷宮大鼠高架十字迷宮(XR-XG201型上海欣軟公司)包括兩個閉臂(50．9cm,寬10．4cm,高40．9cm)與兩個開臂(50．9cm,寬10．4cm),距地面74．3cm。

1.3.2束縛管聚乙烯材料束縛管自制(規(guī)格:長22．6cm,直徑7．9cm)。

1.3.3Westernblot免疫印跡實驗儀器超聲勻漿機(USASonic公司)、高速冷凍離心機(BeckmanAllegra64R)、移液器(1000、200、100、20μL)(德國Eppendorf公司)、UNIC7200型分光光度儀(上海UNIC公司)、-80℃低溫冰箱(Forma,美國)、垂直板電泳轉移裝置(美國Bio-Rad公司)、恒溫水浴搖床(上海比朗儀器有限公司)、多用脫色搖床、多功能酶標儀(美國MultiskanEXPRIMA-RYEIAV.2．3)。

2方法

2.1造模與分組大鼠單籠飼養(yǎng),將大鼠隨機分為空白組、模型組、膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥物組,共6組,每組8只。其中低、中、高劑量組分別按0．75、1．5、3g·kg-1·d-1給予灌胃,DZP組給予1．0mg·kg-1·d-1灌胃,空白組和模型組灌服等容積的生理鹽水,連續(xù)7d灌胃給藥,d5、6、7除空白組外,其他各組在給予藥物后進行急性應激造模。于d5各組灌胃后,參照文獻[12]造模方法并對其進行相應改進,除空白對照組外的其余各組動物放進束縛裝置,束縛管只限制大鼠的活動范圍,對其呼吸并無抑制。束縛期間禁食禁水,束縛結束后恢復自由。每次刺激30min,每日1次,連續(xù)3d。d7給藥束縛后,進行高架十字迷宮測試。

2.2對急性應激大鼠高架十字迷宮行為的影響迷宮測試前,將每只大鼠放入一個45cm×30cm×15cm塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM的中央平臺處,使其頭部正對其中一個開放臂,采用紅外線技術記錄5min內大鼠的活動情況。每次測試完成后,用紙巾清除糞便,隨后濕布蘸取酒精擦拭迷宮,繼而用干布擦凈后再進行下一只大鼠的測試。記錄5min內動物進入開臂次數(openarmentry,OE)、閉臂次數(closearmentry,CE)及迷宮中央區(qū)內的次數及在開臂與閉臂內的運動時間。以進入開臂次數與總入臂次數的百分比(thepercentageofentriestotheopenarms,OE%)及在開臂內運動時間與開臂閉臂內的總時間的百分比(thepercentage oftimespentintheopenarms,OT%)代表抗焦慮作用指標。

2.3Westernblot檢測急性應激大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號通路和BDNF的表達

2.3.1取材大鼠急性應激EPM實驗結束后,立即斷頭處死,迅速取出大腦,于冰盤上快速分離出海馬及皮層,隨后于-80℃低溫冰箱中凍存待用。

2.3.2組織裂解取約200mg海馬或皮層組織,加入預冷的RIPA裂解緩沖液冰浴超聲3×4s,4℃下12000r·min-1離心10min后吸取上清,采用Bradford法測定蛋白濃度后分裝,立即95℃煮10min使蛋白變性,防止蛋白降解,煮后的蛋白可-20℃保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

2.3.3Westernblot測定按Westernblot方法測定p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB蛋白與內參蛋白β-actin的表達,目的蛋白表達量與內參蛋白表達量的比值作為組織內蛋白的相對表達水平。Westernblot具體操作步驟如下:灌膠與上樣:配制12%分離膠,加水封膠。分離膠凝固后將水盡量倒干凈,用濾紙吸干分離膠殘留的水,配制5%的濃縮膠,灌入制膠板,插入樣品梳。待到濃縮膠凝固后,取出樣品梳。加入50μg蛋白的上樣樣品至1．5mL離心管中,加入5×loadingbuffer上樣緩沖液至終濃度為1×,加足量的runningbuffer后上樣。

電泳:110V電壓恒壓電泳2h,電泳至溴酚蘭即將跑出,即可終止電泳,停止電泳,拆開膠板,棄去濃縮膠,取出分離膠。

轉膜操作:將PVDF膜在無水甲醇中浸泡至膜變成灰色透明,馬上取出,放入去離子水中浸泡2min,隨即放入預冷的1×轉膜Buffer中浸泡,浸泡凝膠30min,濾紙、海綿20min,以1×轉膜Buffer注滿電轉膜槽,接通電泳儀,以0．23mA電流恒流轉膜1h。

免疫反應:將膜用TBST從下向上浸濕后,移至含有封閉液的保鮮盒中,室溫下脫色搖床上搖動封閉1h后,4℃冰箱封閉過夜。將p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB、CREB與β-actin蛋白抗體以1×TBST稀釋(1∶1000),將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,4℃冰箱中孵育過夜。然后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10min。同上方法二抗結合(1∶8000),室溫下孵育1h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10min,隨后進行化學發(fā)光反應。

化學發(fā)光、顯影、定影:取ECL發(fā)光工作液A和B兩種試劑各500μL混合后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸1min,將膜用保鮮膜包好后移至X光壓片夾后,進入暗室曝光X片。曝光結束后,放入顯影液中顯影并定影,自來水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干。

凝膠圖像分析:將膠片進行掃描拍照,用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

2.4統計學處理使用SPSS16．0軟件對數據進行統計,計量數據使用x■±s表示。多組間比較采用(One-wayANOVA)單因素方差分析,兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗法,方差不齊時采用Dunnett’sT3進行兩兩比較。

4討論

束縛應激是一種有效的焦慮應激模型,通過數次強度、時間一致的束縛之后,可誘發(fā)動物出現排尿排便增多、修飾行為明顯增多等行為指標,同時,還會影響體內激素及內分泌系統的變化,這些生理反應正是焦慮患者體內的生理變化。

生物學研究認為,調節(jié)正常和病理性焦慮狀態(tài)的神經生物學通路異常是導致焦慮障礙的原因。而海馬和皮層中ERK-CERB信號通路被認為可能與焦慮有關。研究表明,焦慮大鼠腦內p-ERK1/2含量明顯增加,且PD98059阻斷其磷酸化后,可產生明顯抗焦慮的作用。Meller等發(fā)現,急慢性束縛應激可引起大鼠海馬中p-ERK1/2的不同變化,大鼠急性束縛30min后,海馬中p-ERK1/2含量明顯增加,慢性束縛應激11d后,海馬中p-ERK1/2含量明顯減少。CREB轉錄因子的基因表達和對緊張、焦慮的潛在作用也被廣泛研究,Lu等研究表明,28d慢性應激大鼠海馬中p-ERK1/2與p-CREB的含量均明顯減少。然而,也有研究表明14d壓力誘導大鼠海馬中的p-ERK1/2與p-CREB的含量均升高。通過以上結果可以發(fā)現,不同時間應激對p-ERK1/2與p-CREB的含量調控是雙向的。本實驗對大鼠采用3d急性束縛應激,束縛大鼠表現為易受驚嚇、易激惹、被毛豎立;束縛組大鼠在高架十字迷宮模型中表現為排尿、排便次數增多,呈現焦慮狀,且與空白組相比,開臂時間與次數百分比明顯減少,提示3d造�？墒勾笫螽a生焦慮。

因此,本實驗對大鼠海馬和皮層中p-ERK1/2與p-CREB的含量進行測定,以明確復方抗焦慮膠囊對3d急性束縛應激模型大鼠ERK-CERB信號通路的調節(jié)方式。實驗結果表明,束縛應激會增強ERK-CREB通路的活化,導致磷酸化ERK和磷酸化CREB含量的增加,而地西泮和復方抗焦慮膠囊會抑制ERK-CREB過度的磷酸化,提示復方抗焦慮膠囊可能通過影響ERK-CREB信號通路產生抗焦慮作用。

BDNF是最早發(fā)現的神經營養(yǎng)因子,自1989年其cDNA結構被闡明以來,對BDNF的分布及功能有了廣泛的深入研究。研究發(fā)現,BDNF可以調節(jié)神經元和突觸的可塑性,對中樞神經元的增殖和修護有巨大的意義,而焦慮癥的治療也與神經元和突觸的形成有密切關系。本實驗結果表明,應激模型導致大鼠皮層及海馬中BDNF明顯減少,而復方抗焦慮膠囊可以明顯抵消這種減少,從而對皮層和海馬產生保護作用。

ERK-CREB通路與BDNF蛋白的表達關系密切,ERK-CREB通路的變化可以影響BDNF蛋白的表達。BDNF蛋白參與急性焦慮信號。實驗結果表明,復方抗焦慮膠囊對ERK-CREB通路和BDNF蛋白的表達都有明顯的影響,表現為抑制ERK-CREB通路的磷酸化與增加BDNF的表達,因此提示膠囊可能通過調節(jié)它們的相互反應而發(fā)揮其抗焦慮作用。

綜上所述,本實驗結果表明復方抗焦慮膠囊對急性應激模型大鼠具有一定的抗焦慮作用,并且其作用機制可能與影響ERK-CREB信號通路及BDNF的表達有關系,但它們之間深層次的相互影響有待于進一步研究。