核酸檢測(cè)中涉及PCR污染的預(yù)防和處理原則

 一、適用范圍：

本原則適用于涉及PCR方法進(jìn)行食品安全檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室

本原則適用于PCR實(shí)驗(yàn)室污染的預(yù)防和處理。

二、污染來(lái)源：

（1）樣品間的交叉污染：樣品污染主要是由于樣品在運(yùn)輸、儲(chǔ)存、放置過(guò)程中處置不當(dāng)造成的污染。樣品核酸模板在提取過(guò)程中，由于操作不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致樣品間的污染。

（2）試劑的污染：由于操作不當(dāng)，造成核酸提取、擴(kuò)增過(guò)程中各相關(guān)試劑的污染。

（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染。極微量的PCR產(chǎn)物污染就可造成假陽(yáng)性。最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管、開(kāi)蓋、反復(fù)吹吸樣液都可形成氣溶膠而引起污染。

（4）克隆質(zhì)粒的污染：在用克隆質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)克隆質(zhì)粒的污染。

（5）實(shí)驗(yàn)器具的污染：如移液器的污染等。

三、防止污染的方法：

  （1）合理的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)用品，包括移液器等應(yīng)專(zhuān)用。如有可能，應(yīng)在裝有紫外燈的層流式工作臺(tái)（如生物安全柜、超凈工作臺(tái)）內(nèi)，吸加PCR試劑，工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR專(zhuān)業(yè)用的微量離心機(jī)、一次性手套、各量程的移液器和其他必須物品。

  （2）正確的實(shí)驗(yàn)操作：

   a.吸加PCR試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按要求進(jìn)行，吸樣要慢，盡量一次性完成，      忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

   b.實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中應(yīng)勤換手套，在進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后，都應(yīng)及時(shí)更換手套。

   c.裝有PCR試劑的微量離心管在打開(kāi)之前應(yīng)先做瞬時(shí)離心（約10s），將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機(jī)會(huì)。開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。

   d.在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)制備主反應(yīng)混合液，再分裝至PCR反應(yīng)管，最后添加樣品核酸模板，以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。

（3）實(shí)驗(yàn)器具和試劑：

       a.實(shí)驗(yàn)室自己配置的試劑，如去離子水、緩沖液等，在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌。

        b.分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，以減少重復(fù)取樣次數(shù)，并置于-20℃保存，適當(dāng)時(shí)，最好做到專(zhuān)人專(zhuān)用。另外，PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱。

       c.所有吸頭、反應(yīng)管等應(yīng)一次性使用，使用之前，都應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓處理。若條件允許，最好使用帶濾器的槍頭。各工作區(qū)內(nèi)的移液器要有標(biāo)識(shí)，應(yīng)固定使用用途，不能交叉使用。     

 （4）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)中至少應(yīng)：

   a.設(shè)置目標(biāo)DNA陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)。對(duì)靶序列所作的適當(dāng)?shù)南♂尮ぷ鲬?yīng)于實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)別的位置進(jìn)行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實(shí)驗(yàn)室中專(zhuān)門(mén)進(jìn)行PCR的位置。

   b. 設(shè)置PCR試劑陰性對(duì)照和目標(biāo)DNA陰性對(duì)照反應(yīng)。

四、分析污染原因：

（1）試劑污染：檢測(cè)陰陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果。如果陰性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明PCR反應(yīng)體系中某一種或數(shù)種試劑被污染。若陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)為陰性，則說(shuō)明PCR反應(yīng)體系中存在抑制物質(zhì)，或一種至數(shù)種PCR反應(yīng)試劑失效。

（2）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性之后，如果污染情況仍存在，則考慮可能為環(huán)境污染。常見(jiàn)的污染源可能為各種實(shí)驗(yàn)表面的污染，包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、儀器設(shè)備表面、各種開(kāi)關(guān)或把手等：對(duì)于這些污染可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源。其步驟如下：

        a.用無(wú)菌水浸泡過(guò)的無(wú)菌棉簽擦拭可疑污染源；

        b.0.1mL去離子水浸泡；

        c.取5μL做PCR實(shí)驗(yàn)；

        d.電泳檢測(cè)結(jié)果。

如果經(jīng)過(guò)上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的。

五、污染處理：

   （1）環(huán)境污染：

     a.稀酸處理法：對(duì)可以器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。

     b.紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254nm和300nm，照射30min即可。選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。

     c.若可能是氣溶膠污染，應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物（與原引物無(wú)相關(guān)性）。

（2）試劑污染：

      若經(jīng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，為試劑造成的污染，應(yīng)立即更換試劑。