角膜緣干細胞的量子點標記及體外移植示蹤

體外培養(yǎng)的人角膜緣上皮細胞（Human Limbal Epithelial Cells, HLEC）在治療角膜緣干細胞缺陷性疾病方面顯示良好的應用前景。但是，對于其移植后的存活狀態(tài)、行為方式以及長期效應等尚不明確。倫敦大學眼科研究所及莫菲爾眼科醫(yī)院Alex J. Shortt課題組，應用量子點技術作為HLEC體外移植的示蹤工具，并對其行為和有效性進行了評價。

Nuria Genicio等體外分離培養(yǎng)HLEC細胞，以偶聯(lián)穿膜肽的量子點標記細胞，通過細胞活力分析實驗確定，量子點標記沒有產(chǎn)生細胞毒性；克隆形成實驗顯示，量子點標記對于細胞增殖沒有明顯影響；對于干細胞及其分化標記物CK3、p63以及ABCG2等的表達分析顯示，量子點標記不影響HLEC的分化。接下來，利用器官培養(yǎng)模型形成去細胞的角鞏膜緣，然后將體外培養(yǎng)并標記量子點的HLEC細胞培養(yǎng)層移植入角鞏膜緣（圖1），在之后的示蹤觀察中，雖然細胞增殖導致量子點熒光信號逐漸減少，但是仍足以示蹤多次傳代的細胞，應用激光共聚焦顯微鏡可持續(xù)觀察至少2周（圖2）。上述實驗對于臨床干細胞治療提供了基礎實驗數(shù)據(jù)，同時尚需應用在體模型進行深入分析與評價。

圖1 以量子點（紅色）標記HLEC細胞培養(yǎng)層并移植入器官培養(yǎng)模型。

（A）標記量子點（紅色）的HLEC細胞培養(yǎng)層于熒光顯微鏡下成像；（B）通過蛋白酶消化，量子點標記的HLEC細胞培養(yǎng)層從培養(yǎng)基底脫落；（C）器官培養(yǎng)室中去細胞的人角鞏膜緣；（D）HLEC細胞培養(yǎng)層移植后7天，與角鞏膜緣重構的激光共聚焦圖片。

圖2 量子點標記（紅色）的HLEC細胞培養(yǎng)層移植入去細胞的角鞏膜緣及其示蹤。

• A列及D列提示相鄰的圖像采集部位；
• B列及C列顯示移植后7天及14天，角膜表面呈現(xiàn)量子點標記的HLEC細胞；
• E列及F列顯示移植后7天及14天，角鞏膜緣表面呈現(xiàn)量子點標記的HLEC細胞；
• 移植后7天，完整的上皮層覆蓋全部角膜（B）和角膜緣（E），其中大量細胞有量子點標記，提示移植細胞存活超過7天；另外，角膜緣區(qū)域（E）比角膜區(qū)域（B）呈現(xiàn)更多標記量子點的細胞，同時，角膜緣區(qū)域呈現(xiàn)標記明亮量子點的細胞簇集（E），但是在角膜區(qū)域（B）沒有該現(xiàn)象；
• 移植后14天，量子點標記細胞減少，但是仍有完整的上皮層覆蓋角膜（C）和角膜緣（F），角膜區(qū)域（C）量子點信號的下降較角膜緣（F）更加顯著；在角膜緣區(qū)域（F），含有明亮量子點的細胞簇集持續(xù)至移植后2周，但是不如初始時刻顯著。

文獻來源：

Genicio N, Gallo Paramo J, Shortt AJ. Quantum dot labeling and tracking of cultured limbal epithelial cell transplants in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(5):3051-9.