銳博生物：Gut：IR-58—潛在的結(jié)腸直腸癌靶向藥物的鑒定

重慶第三軍醫(yī)大學(xué)史春夢(mèng)教授課題組于2016年11月14號(hào)在Gut雜志（IF：14.921）發(fā)表了名為《Identification of a fluorescent small-molecule enhancer for therapeutic autophagy in colorectal cancer by targeting mitochondrial protein translocase TIM44》的文章，首次鑒定了一種新的近紅外（NIR）熒光團(tuán)自噬增強(qiáng)子可作為潛在的結(jié)腸直腸癌靶向藥物，我們一起來(lái)看看吧。
 
目的： 由于對(duì)自噬過(guò)程的調(diào)節(jié)有益于癌癥治療，因此鑒定新型自噬增強(qiáng)子具有重要意義。 然而，目前的自噬誘導(dǎo)抗癌劑由于其在靶外組織中的非特異性生物分布而發(fā)揮副作用。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種多功能試劑，以整合癌靶向，成像和治療，并調(diào)查其機(jī)制。
 
設(shè)計(jì)： 合成、篩選和鑒定一系列靶向線粒體的近紅外（NIR）熒光團(tuán)，使其自噬活性增強(qiáng)，并在體外和體內(nèi)測(cè)試光學(xué)性質(zhì)和生物效應(yīng)。使用抑制劑，小干擾RNA（siRNA），RNA測(cè)序，質(zhì)譜和人類樣品等研究基礎(chǔ)機(jī)制。
 
結(jié)果：研究者篩選并鑒定了一種新的NIR自噬增強(qiáng)子，IR-58，它表現(xiàn)出顯著的腫瘤選擇性殺傷作用。
 
1. IR-58合成途徑

圖1  IR-58能夠在CRC細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬（圖1A）。 IR-58的化學(xué)合成方法如圖1B所示。合成化合物2和4之后，在Et 3 N催化作用下，用化合物2和4進(jìn)行酰胺化反應(yīng)合成關(guān)鍵中間體（化合物5，產(chǎn)率60％）。使用1H-核磁共振（1 H-NMR）測(cè)出化合物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)。隨后，使用2,3,3-三甲基-3H吲哚和化合物5在1,2-二氯苯中進(jìn)行N-烷基化反應(yīng)制備吲哚季銨鹽形式的化合物6。最后，化合物6與化合物7反應(yīng)用乙酸鈉作為催化劑通過(guò)縮合作用合成IR-58（1.63g，產(chǎn)率30％，綠色粘性固體）。
 
2. IR-58細(xì)胞及其動(dòng)物體內(nèi)功能研究
研究者研究了在HT-29與HCT116 CRC移植瘤中，IR-58優(yōu)先于腫瘤富集的潛能。在裸鼠皮下植入人類HT-29與HCT116 CRC移植瘤，單次靜注IR-58后成像。

圖2 A,B展示了注射IR-58后移植瘤呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光。并通過(guò)組織病理學(xué)分析證實(shí)了IR-58碘化物在腫瘤細(xì)胞溶質(zhì)中富集。通過(guò)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示IR-58僅累積在腫瘤細(xì)胞的線粒體中（圖D）。由于線粒體是細(xì)胞的能量中心，并且IR-58位于線粒體，研究者推測(cè)IR-58的攝取是能量依賴性的并得到了證實(shí)。（圖E，F(xiàn)）。HT-29和HCT116細(xì)胞用2-脫氧-d-葡萄糖（2-DG;糖酵解抑制劑）和寡霉素（氧化磷酸化抑制劑）預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)2-DG顯著抑制IR-58的攝取，表明IR-58的攝取是糖酵解依賴性的，而寡霉素沒(méi)有這種效果（圖E，F(xiàn)）。當(dāng)用磺基溴蛋白（BSP，OATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）預(yù)處理HT-29和HCT116細(xì)胞后，熒光值顯著低于未處理的細(xì)胞，這表明IR-58的攝取是通過(guò)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP）介導(dǎo)（圖G，H）。
 
3. IR-58的作用機(jī)制研究
 
IR-58優(yōu)先富集在結(jié)腸直腸癌（CRC）細(xì)胞和異種移植物的線粒體中，這是一種糖酵解依賴性和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽依賴性的過(guò)程。 IR-58通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)度自噬（其通過(guò)活性氧（ROS）-Akt-哺乳動(dòng)物類雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑介導(dǎo)）殺死腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡。 RNA測(cè)序，質(zhì)譜和siRNA干擾研究表明線粒體內(nèi)膜44（TIM44） - 超氧化物歧化酶2（SOD2）途徑轉(zhuǎn)位酶受抑制導(dǎo)致IR-58誘導(dǎo)過(guò)度的ROS，自噬和細(xì)胞凋亡。 TIM44表達(dá)與CRC發(fā)展和患者預(yù)后不良呈正相關(guān)。

圖3 用10μM IR-58 對(duì)HT-29, HCT116 , A549 細(xì)胞處理24小時(shí)并設(shè)置空白對(duì)照，然后進(jìn)行RNA測(cè)序與質(zhì)譜分析，重疊基因的mRNA表達(dá)增加。

圖4  擬建IR-58自噬誘導(dǎo)機(jī)制模型。 IR-58優(yōu)先以有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP）依賴性和糖酵解依賴性方式富集在腫瘤細(xì)胞的線粒體中。 IR-58顯著抑制線粒體膜內(nèi)44（TIM44）轉(zhuǎn)位酶表達(dá)，使得超氧化物歧化酶2（SOD2）進(jìn)入線粒體的攝取量減少，導(dǎo)致過(guò)度的活性氧（ROS）產(chǎn)生與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的去磷酸化，引發(fā)自噬。 隨后，觸發(fā)內(nèi)源性凋亡。 PARP，聚ADP-核糖聚合酶。

結(jié)論：開(kāi)發(fā)了一種新型NIR小分子自噬增強(qiáng)子，IR-58，具有線粒體靶向成像和治療能力，用于CRC治療。此外，TIM44第一次被確定為潛在的致癌基因，其通過(guò)TIM44-SOD2-ROS-mTOR途徑在自噬中起重要作用。
 
新發(fā)現(xiàn)：IR-58被確定為優(yōu)先富集在腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)特定目標(biāo)腫瘤部位線粒體中的一種新的腫瘤自噬誘導(dǎo)小分子染料。
 
它在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)如何影響臨床實(shí)踐？
IR-58可能代表一種新型自噬誘導(dǎo)殺腫瘤小分子增強(qiáng)劑，而TIM44-SOD2-ROS-mTOR通路可能是臨床CRC治療的潛在靶標(biāo)。 這項(xiàng)工作還可能提供一個(gè)潛在的策略來(lái)開(kāi)發(fā)多功能小分子試劑用于成像指導(dǎo)的CRC治療，這可以增強(qiáng)腫瘤靶向的特異性和減少離體靶組織中的潛在副作用，以及使實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)。
 
原文：Huang Y, Zhou J, Luo S, et al. Identification of a fluorescent small-molecule enhancer for therapeutic autophagy in colorectal cancer by targeting mitochondrial protein translocase TIM44[J]. Gut, 2016: gutjnl-2016-311909.
 

本研究中所用到的RNA Sequencing由銳博生物提供，所涉及到的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及siRNA銳博生物均有提供。
 
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