質(zhì)譜法進(jìn)行高通量蛋白鑒定的主要方法介紹

  蛋白質(zhì)組（Proteome）指由一個(gè)基因組或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)全譜分析目的在于鑒定樣本中盡可能多的肽和蛋白質(zhì)混合物的組分。基于質(zhì)譜技術(shù)的全譜鑒定，可為蛋白高通量的定量和修飾分析提供參考信息。傳統(tǒng)的方法如蛋白質(zhì)微量測(cè)序、氨基酸組成分析（如Edman降解法）費(fèi)時(shí)費(fèi)力、通量低，存在不容易實(shí)現(xiàn)規(guī)�；�和自動(dòng)化，結(jié)果靈敏度差等問題。當(dāng)前主流的基于軟電離技術(shù)的液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)（LC-MS/MS）是實(shí)現(xiàn)高通量蛋白鑒定的主要方法。

  其基本原理是：首先將純化后的蛋白質(zhì)用消化酶（如胰酶）水解成肽段，肽段混合物經(jīng)過除鹽后首先進(jìn)入液相色譜，實(shí)現(xiàn)初步分離，以降低樣品復(fù)雜度。經(jīng)液相色譜分離后的肽段先經(jīng)過質(zhì)譜的第一級(jí)--離子源（ESI，MALDI）使肽段離子化并形成分散的離子。接著選擇部分強(qiáng)度較高的肽段母離子進(jìn)入質(zhì)譜的第二級(jí)系統(tǒng)（碎裂源）做進(jìn)一步碎裂，使肽段離子被打碎成更小的、有規(guī)律的碎片離子。理論上蛋白質(zhì)序列經(jīng)過酶解后形成肽段，肽段再經(jīng)過理論二級(jí)碎裂形成理論的二級(jí)碎片離子譜圖。然后用實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的MS/MS譜圖信息（主要包括質(zhì)荷比、離子強(qiáng)度）與理論產(chǎn)生的MS/MS譜圖信息比對(duì)，通過比較兩者的相似度來確定譜圖對(duì)應(yīng)哪個(gè)肽段/蛋白（如圖1）。其中理論蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來自基因組預(yù)測(cè)或前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等數(shù)據(jù)。

目前，常用的數(shù)據(jù)庫有NCBI-nr（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 、Uniprot（ http://www.uniprot.org/）等。常用的搜索引擎有Mascot（ http://www.matrixscience.com/） 、Proteinpilot

（http://www.absciex.com/products/software/proteinpilot-software）。Mascot一度被業(yè)界奉為鑒定軟件的金標(biāo)準(zhǔn)，但其算法更偏向于鑒定長(zhǎng)度較短的肽段序列。而Proteinpilot由于采用自動(dòng)容錯(cuò)匹配、對(duì)所有可能的蛋白修飾采用了盲搜的策略，無肽段長(zhǎng)度偏向性，鑒定效果更好。

圖1 蛋白質(zhì)組鑒定流程圖

1、通量大：一次實(shí)驗(yàn)可鑒定6000多種蛋白質(zhì)（以人HepG2為例）；

2、結(jié)果準(zhǔn)確可靠：質(zhì)譜儀的質(zhì)量精度可達(dá)到1ppm以下，分辨率能達(dá)到4x10⁴以上，可提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

3、適用范圍廣泛：對(duì)物種要求無限制，理論上適用于任何物種。

經(jīng)典案例：

題目：A draft map of the human proteome（人類蛋白質(zhì)組草圖繪制）

期刊：Nature

主要技術(shù)：LC-MS/MS

文章摘要：采用LC-MS/MS技術(shù)，對(duì)30個(gè)來自正常人類的不同組織、器官（17個(gè)成年人組織、7個(gè)胎兒組織、6個(gè)初級(jí)純化造血細(xì)胞）樣品進(jìn)行了深度蛋白質(zhì)組解析，共鑒定到17294個(gè)蛋白，占人類全部有注釋編碼蛋白基因的84%。本文同時(shí)采用蛋白質(zhì)組和基因組學(xué)（Proteogenomic）的方法發(fā)現(xiàn)了一些新的編碼區(qū)（這些區(qū)域過去被認(rèn)為是非編碼區(qū)）。這一海量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)將會(huì)補(bǔ)充現(xiàn)有的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從而加速健康、疾病方面的生物醫(yī)學(xué)研究。

圖2 人體中不同樣品來源

圖3 鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫PeptideAtlas 和GPMDB收錄的結(jié)果比較