基因芯片與RNA-seq的比較分析

基因芯片 vs RNA-seq哪個(gè)好 ？

最近幾年二代測(cè)序（又叫NGS）很火，而且價(jià)格越來(lái)越便宜，原來(lái)都用芯片檢測(cè)mRNA、miRNA、LncRNA表達(dá)量的，好像不少都換用RNA-seq了。那么，到底選擇哪種更好呢？今天就來(lái)回答下這個(gè)問(wèn)題。一句話—— 看研究目的。

常見(jiàn)誤區(qū)一：

測(cè)序的準(zhǔn)確性高，獲得的信息更豐富

對(duì)，但又不對(duì)。 

首先，大家需要明確，檢測(cè)到和準(zhǔn)確分析基因表達(dá)量的概念是不同的，只有mapping到基因上的reads達(dá)到一定數(shù)量，才能得到相對(duì)準(zhǔn)確的分析結(jié)果。因此RNA-Seq能檢測(cè)到多少可靠的信息完全取決于測(cè)序深度，測(cè)序深度，測(cè)序深度！不同于芯片的雜交法，RNA-seq是通過(guò)讀數(shù)來(lái)檢測(cè)，讀數(shù)多（即測(cè)序深度深）代表著RNA-seq的采樣率高。采樣率低了準(zhǔn)確度自然就低了。

那么有沒(méi)有一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)苷f(shuō)明芯片和RNA-seq之間數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度的差異呢？

發(fā)表在PNAS上面的這篇文章就幫大家做了一個(gè)對(duì)比（PNAS 2011, 108(9):3707-3712.）。圖中綠色點(diǎn)/黑色線是測(cè)序得到的數(shù)據(jù)，紅色點(diǎn)/紅色線是芯片得到的數(shù)據(jù)。在～50M reads數(shù)據(jù)量的情況下，當(dāng)基因表達(dá)豐度較高時(shí)（橫坐標(biāo)RPKM較大時(shí)），兩者之間的數(shù)據(jù)質(zhì)量都是非常好的（縱坐標(biāo)CoV即變異系數(shù)越小，數(shù)據(jù)質(zhì)量越高），但當(dāng)基因表達(dá)豐度變低時(shí)（橫坐標(biāo)RPKM較小時(shí)），RNA-seq的數(shù)據(jù)質(zhì)量就急劇下降了，而芯片則仍然維持著高水準(zhǔn)。這篇文章得到的結(jié)論是：～80%以上的基因，RNA-seq的數(shù)據(jù)質(zhì)量/可信度都低于芯片。市場(chǎng)上最流行的的6G數(shù)據(jù)量的RNA-seq，其實(shí)就是40M reads或者20M paired reads，對(duì)于研究高表達(dá)豐度的基因來(lái)說(shuō)，差不多是夠用了。但是對(duì)于中、低表達(dá)豐度轉(zhuǎn)錄本就不夠用了。

常見(jiàn)誤區(qū)二：

RNA-seq可以同時(shí)檢測(cè)已知和未知基因，基因芯片只能檢測(cè)已知基因，這是一個(gè)巨大的局限。

首先，這個(gè)觀點(diǎn)的一個(gè)潛在假設(shè)是，每次測(cè)序都能夠發(fā)現(xiàn)一些未知分子。但對(duì)于人、大鼠、小鼠以及其他一些模式生物，該發(fā)現(xiàn)的基因基本上都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)完了。因此基因是否已知，在很多情況下并非重點(diǎn)，重點(diǎn)在于該基因在您研究的領(lǐng)域中功能是否已知。芯片上已知基因的功能大多都還不清楚，只是盲目地去追求發(fā)現(xiàn)新分子并不可取。

在探索性研究和非模式生物研究中，RNA-seq才是更合適的選擇。

常見(jiàn)誤區(qū)三：

RNA-seq現(xiàn)在已經(jīng)很便宜了，比基因芯片還便宜很多。

測(cè)序中收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)之一來(lái)源于數(shù)據(jù)量（即測(cè)序深度），剛剛說(shuō)了，市場(chǎng)上最流行的的RNA-seq服務(wù)數(shù)據(jù)量是6G/樣本，即40M reads或者20M paired reads ，這時(shí)候確實(shí)比很多芯片都便宜了。但是如果希望更準(zhǔn)確檢測(cè)中、低豐度RNA，就需要更深度的測(cè)序保證數(shù)據(jù)可靠性，這就會(huì)導(dǎo)致測(cè)序成本急劇上升。下表幫大家總結(jié)了一些常見(jiàn)研究的測(cè)序數(shù)據(jù)要求。Nature biotechnology有篇文章指出，如想要檢測(cè)lncRNA、轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體等一般表達(dá)豐度極低的轉(zhuǎn)錄本，至少需要300M reads的測(cè)序量才能達(dá)到80%的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度（Nature biotechnology, 2014, 32(9): 903-914.）。

那么芯片又如何呢？拿Affymetrix HTA系列的芯片來(lái)說(shuō)，它的數(shù)據(jù)量，可是相當(dāng)于480M reads測(cè)序深度！哇，好像看到了好多錢 

常見(jiàn)誤區(qū)四：

 RNA-seq在測(cè)表達(dá)量的同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)突變，基因芯片不能。

基因芯片（這里專指測(cè)RNA的表達(dá)譜芯片）確實(shí)不能發(fā)現(xiàn)突變。RNA-seq是通過(guò)測(cè)序來(lái)檢測(cè)RNA豐度的，確實(shí)可以獲得序列信息，但是因?yàn)闇y(cè)序本身有錯(cuò)誤率，而RNA-seq常做的測(cè)序深度很低，得到的突變信息其實(shí)并不準(zhǔn)確。要想準(zhǔn)確，就需要極高的測(cè)序深度，那么又回到老問(wèn)題了，成本基本是不可接受的。

那么有些同學(xué)要問(wèn)啦，市場(chǎng)上的基因芯片有好多種啊，不知從何入手？小編下期再給大家聊聊基因芯片類型的選擇。

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