細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問(wèn)題及解答(一)

小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別？應(yīng)用注意事項(xiàng)？

來(lái)源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時(shí)候,通過(guò)心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛（小牛）血清（Calf serum, CS）采自出生10至14 天的小牛。

組份與比例不同：兩者所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同，用途與用法不同：某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長(zhǎng)，而有些細(xì)胞只需小牛血清即可，使用濃度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意：血清應(yīng)保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超過(guò)一個(gè)月。解凍血清時(shí)，應(yīng)先將血清至于2-8℃冰箱，并經(jīng)常搖勻使之溶解，然后至室溫放置使之升溫，絕對(duì)不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中，如放在37℃解凍，顏色加深，粘稠度也會(huì)增加，血清在解凍和熱滅活后，應(yīng)按用量分裝并于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

胰酶消化傳代的濃度是多少？是否含EDTA？濃度？

胰酶消化傳代的一般濃度為0.25%，部分細(xì)胞由于貼壁較緊，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培養(yǎng)，胰酶的濃度需要做適當(dāng)?shù)奶岣摺?/span>

常用細(xì)胞株推薦的培養(yǎng)基及特殊要求？

常規(guī)培養(yǎng)基的選用一般原則，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以RPMI1640為主、貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞以DMEM為主，部分細(xì)胞需用特殊培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)，如Mccoy’5A、L-15、F12K、D+F12 等等。

細(xì)胞株的污染鑒定、預(yù)防和處理問(wèn)題。

普通微生物污染：培養(yǎng)基渾濁，高倍鏡觀察有微生物污染；按規(guī)定棄用并全面嚴(yán)格滅菌。

 支原體污染：顯微鏡無(wú)法觀察，依經(jīng)驗(yàn)表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，有細(xì)胞漂浮等等，應(yīng)通過(guò)PCR 等方法鑒定，如發(fā)現(xiàn)支原體污染，應(yīng)按規(guī)定棄用，實(shí)驗(yàn)室要及時(shí)全面消毒滅菌，防止蔓延。（有些常規(guī)性細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)不受支原體污染影響，可以繼續(xù)使用細(xì)胞傳代，為防污染擴(kuò)大蔓延，可以選擇性的在培養(yǎng)基中加入高效價(jià)的其它種抗生素，并在隔離實(shí)驗(yàn)室操作和獨(dú)立使用一切用具與培養(yǎng)基等）。

如何傳代貼壁細(xì)胞？

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。

懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化貼壁細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一種二價(jià)離子的螯合劑，能抑制細(xì)胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細(xì)胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗細(xì)胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后棄去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask)，觀察細(xì)胞直到細(xì)胞變圓脫離瓶壁，此過(guò)程一般需要5-15分鐘，為了避免細(xì)胞成團(tuán)，消化細(xì)胞的過(guò)程中不要拍打細(xì)胞瓶。對(duì)于特別難消化的細(xì)胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細(xì)胞置于37°C 促進(jìn)消化，細(xì)胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培養(yǎng)基中止消化，血清中某些蛋白質(zhì)能夠抑制胰酶的活性。

一般情況下，離心并不需要。如果細(xì)胞需要無(wú)血清或者低血清的培養(yǎng)基，可以以125000g 轉(zhuǎn)速離心5分鐘，然后棄去中止用的培養(yǎng)基，加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞，移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細(xì)胞類型而定，一般是1:2-1:20，具體比例可參考說(shuō)明書(shū)。胰蛋白酶會(huì)對(duì)某些細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，對(duì)于這種類型的細(xì)胞，可用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細(xì)胞，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

傳代細(xì)胞的頻率多久較合適？

傳代是指把細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶，傳代的間隔是指兩次傳代之間的時(shí)間。

貼壁型的細(xì)胞的匯合度達(dá)到或者接近100%的時(shí)候，需進(jìn)行傳代操作，但是，有些細(xì)胞以克隆的形式生長(zhǎng)，匯合度永遠(yuǎn)達(dá)不到100%，對(duì)于這種類型的細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到或者接近最大密度的時(shí)候，就需傳代。接觸抑制型細(xì)胞（比如3T3）需要在細(xì)胞長(zhǎng)滿之前傳代以避免產(chǎn)生細(xì)胞長(zhǎng)滿后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。懸浮型的細(xì)胞必須在細(xì)胞達(dá)到最大飽和密度之前傳代，懸浮細(xì)胞傳代時(shí)只需稀釋至合適的密度，讓細(xì)胞有充足的營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

如果僅僅是簡(jiǎn)單的換液，而且細(xì)胞數(shù)量不減少，細(xì)胞將會(huì)快速耗盡營(yíng)養(yǎng)而死亡；如果細(xì)胞稀釋到最低密度之下，細(xì)胞將會(huì)進(jìn)入停滯期而不增殖或者死亡。不同的懸浮細(xì)胞的最大飽和密度和傳代的間隔與比例是不同的，所以，培養(yǎng)懸浮細(xì)胞要每日觀察。

如何處理對(duì)于生物安全性不清楚地腫瘤細(xì)胞株？ 

了解每株細(xì)胞可能產(chǎn)生的生物危害是很難的，但是強(qiáng)烈推薦，所有的人類和其他靈長(zhǎng)類生物的細(xì)胞在能否預(yù)防HIV和肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)條件下操作，所有的操作必須在垂直層流超凈臺(tái)內(nèi)操作（推薦生物安全柜），操作過(guò)程中產(chǎn)生的廢液和廢儀器都要經(jīng)過(guò)清洗、酸處理等處理后才能丟棄。

能否使用細(xì)胞說(shuō)明書(shū)上不同的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞？

產(chǎn)品目錄或者細(xì)胞說(shuō)明書(shū)上的推薦的培養(yǎng)基一般是細(xì)胞株的原始提供者推薦的培養(yǎng)基或者已經(jīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的對(duì)該細(xì)胞株最合適的培養(yǎng)基，細(xì)胞對(duì)未推薦的培養(yǎng)基也許會(huì)適應(yīng)，也有可能不適應(yīng)。對(duì)于更換培養(yǎng)基，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待，更換培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)留一瓶細(xì)胞使用推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng)，留作種子。

更換培養(yǎng)基有兩種方法，最簡(jiǎn)單的方法是直接更換培養(yǎng)基，強(qiáng)制使細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基；還有一種更溫和的方法：傳代細(xì)胞的時(shí)候分成細(xì)胞兩瓶，第一瓶使用原來(lái)推薦的培養(yǎng)基，第二瓶使用50%原來(lái)推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，之后仔細(xì)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，如果第二瓶細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，應(yīng)立即停止更換培養(yǎng)基，如果第二瓶生長(zhǎng)狀態(tài)好，可以繼續(xù)傳代分瓶，一瓶使用50%原來(lái)推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，另一瓶使用25%原來(lái)推薦的培養(yǎng)基，75%新的培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察，如果細(xì)胞狀態(tài)好，可以全部換成新鮮的培養(yǎng)基。

相關(guān)鏈接：

• 細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題（二）
• 細(xì)胞株培養(yǎng)
• 原代細(xì)胞培養(yǎng)
• 各類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)