不同強度重復經顱磁刺激對腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響

摘要

目的：研究不同強度重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, , rTMS )對腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響。

方法：雄性成年SD大鼠40只，體重200 -250 g ，采用改良Zea longa線栓法對大鼠制作右側大腦中動脈閉塞的腦梗死模型。建模成功的大鼠隨機分為模型組及40% (0.76 T),60% (1.14 T),80% (1.52 T)強度刺激組，每組8只，另外假手術組8只。各刺激組大鼠于建模成功后第5d開始按照設定參數分別接受磁刺激，連續(xù)5 d,假手術組和模型組置于相同磁場環(huán)境，但不接受磁刺激。治療結束后，給予各組大鼠相同足底電擊(55 V,2 s)，在24 h后檢測大鼠在5 min內的僵直持續(xù)時間。結果各刺激組大鼠在接受足底電擊24 h后的僵直持續(xù)時間均明顯高于模型組(P < 0.01)，并且隨著刺激強度的增加，大鼠在24 h后的僵直持續(xù)時間也明顯增長(P < 0.01)。結論:rTMS能促進腦梗死大鼠記憶功能的恢復，并隨著刺激強度的加強，大鼠記憶能力的恢復程度亦增強。

腦梗死(cerebral infarction)是指因腦部血液供應障礙，缺血、缺氧所導致的局限性缺血性壞死或軟化。作為一種高發(fā)病率和高致殘率的疾病，腦梗死給人類健康和生命帶來威脅的同時也影響患者日常生活能力，給社會及家庭帶來沉重的負擔。重復經顱磁刺激技術(repetitive transcranial magnetic stimula-tion, , rTM S是一種利用脈沖磁場作用于中樞神經系統(tǒng)(主要是大腦)，改變皮層神經細胞的膜電位，使之產生感應電流，影響腦內代謝和神經電活動，從而引起一系列生理生化反應的磁刺激技術，作為一種新的精神神經系統(tǒng)治療技術，具有無痛、無創(chuàng)、安全和操作簡便等優(yōu)點，目前已廣泛應用于治療帕金森病、癲癰、抑郁癥、腦梗死、脊髓損傷等疾病的臨床治療中，并取得了較好的療效。條件性恐懼的形成是一種學習和記憶的過程，本研究旨在通過對腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的觀察來研究 rTM S對腦梗死后大鼠學習記憶功能的恢復作用，同時探索其治療強度與功能恢復程度的關系，為rTMS將來更好地應用于臨床腦梗死患者的治療提供指導依據。

材料與方法

1.1實驗動物

SPF級成年SD雄性大鼠，體重約200一250(由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)，鼠齡12周，在飼養(yǎng)籠里給予12 h光/暗周期，可自由采食水和食物，隨機取8只作為假手術組，其余大鼠制成右側大腦中動脈栓塞腦梗死模型，將造模成功的大鼠隨機分為模型組及40% (0.76 T) ,60% (1.14 T) ,80%(1.52 T)強度刺激組，每組8只。

1.2儀器

武漢依瑞德公司生產的磁場刺激儀(CCY-1型);上海欣軟superfcs條件性恐懼實驗系統(tǒng)

1.3腦梗死動物模型的制作

參照改良Zea longa線栓法制成右側大腦中動脈缺血模型。動物蘇醒后表現為提尾時左側前肢內收屈曲;同側Homer氏征;爬行時向左劃圈;站立時左側傾倒。凡具有上述體征者列入研究對象。共用大鼠100只，有32只符合入選條件并存活到規(guī)定時間。假手術組僅作右側頸內動脈結扎，術后無病理行為學改變。

1.4治療方法

刺激組在造模成功后第2d行rTM S治療，將大鼠頭部固定，使其在刺激過程中保持清醒、安靜和舒適。磁場線圈中心處于大鼠肉門右旁開0.5 cm處。設計刺激參數為:刺激頻率1 Hz，刺激強度為40%(0.76 T),60%(1.14 T),80%(1.52 T)輸出強度;3組/d,5序列/組，20次/序列，每個序列間隔l0s，每組間隔60 s，連續(xù)刺激5d，每天于14:00一15:00實施刺激，假手術組和模型組置于相同磁場環(huán)境，但不接受磁刺激。

1.5記憶能力評價

實驗分為訓練和檢測兩個部分，各組大鼠均于治療結束后第2d行場景性條件性恐懼實驗。每次使用電擊箱前用95%乙醇擦拭箱底和鋼絲，將大鼠分別置于無聲，無特殊氣味的測試箱中，適應3 min后，開始給予短暫足底電擊(SSV,2s)共6次，2次足底點擊時間間隔平均為90 s ( 60一120 s隨機變化)，最后1次電擊結束后30 s將大鼠放回飼養(yǎng)籠。訓練結束24 h后進行記憶形成和保持能力的測試，將大鼠放入同一電擊箱中無電刺激呈現，觀察并用秒表記錄大鼠5 min內僵直(Freezing)反應時間。僵直的判定標準是動物接受刺激信號后，除呼吸運動外，全身其他軀體運動全部停比的狀態(tài)。在這一行為模型中，僵直反應時間的長短反映大鼠對電擊這一場景的恐懼記憶程度。

1.6統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0版統(tǒng)計學軟件包進行數據處理，每組樣本數據用均數士標準差表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

與假手術組相比，模型組大鼠恐懼記憶能力明顯下降，rTMS組大鼠恐懼記憶能力均明顯高于模型組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)，在刺激組中，隨著刺激強度的增加，大鼠在24 h的僵直時間也明顯增長，差異具有統(tǒng)計學意義(P < 0.01)。見表1。

3討論

重復經顱磁刺激(rTM S )是1991年在經顱磁刺激基礎上發(fā)展起來的新的神經電生理技術，無痛無創(chuàng)、操作方便、安全可靠，能影響局部和遠隔皮層功能，實現皮層功能區(qū)域性重建，影響多種神經遞質和基因表達水平，目前在抑郁癥、帕金森病、癲癰、神經J哇疼痛、脊髓損傷和腦卒中等疾病臨床治療中得到廣泛的應用。臨床研究表明，rTMS能促進腦梗死患者肢體功能的恢復和提高患者的日常生活能力[n}。目前研究中腦梗死大鼠學習記憶行為評估實驗多以Y型迷宮和水迷宮為主[A-9]，條件性恐懼的形成也是一種學習和記憶的過程，本研究以條件性恐懼記憶作為學習記憶評估實驗，結果顯示rTMS能促進腦梗死大鼠記憶功能的恢復，并隨著刺激強度的加強，腦梗死大鼠記憶能力的恢復程度亦增強。

目前，有關rTMS能促進腦梗死大鼠記憶能力恢復可能的機制研究較多。已有研究報道, rTMS能促進腦梗死大鼠海馬突觸素(Syn)的表達，Syn是突觸囊泡的一種特異標志性膜蛋白，其數量和分布密度可間接反映突觸的密度，突觸作為神經元之間在功能上發(fā)生聯系的部位，其密度增多，海馬區(qū)神經元之間的傳遞和聯系隨之增強;此外，磁刺激也可增加腦梗死側皮層腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，促進神經元再生，刺激軸突的芽生和新突觸的形成，抑制促凋亡蛋白Bax , BAD等，從而對腦梗死部位產生多種神經保護效應mo;另有研究報道 , rTMS治療也能抑制缺血組織神經細胞的凋亡和增加神經可塑性，可用于腦梗死后亞急性期記憶功能恢復的治療;另外，rTMS能調節(jié)miR-25/p57信號通路，能促進腦梗死后腦室下區(qū)成體神經干細胞的增殖，加強腦梗死后的自我修復能力。

rTMS對腦梗死患者療效作用與許多因素有關，主要因素則是刺激參數的設置如強度、頻率、刺激持續(xù)時間等，本實驗在保證除強度外的其它參數相同的前提下發(fā)現隨著刺激強度的加強，大鼠記憶能力的恢復程度亦增強。有文獻報道，這可能與磁刺激能影響星形膠質細胞的遷移有關，且隨著刺激強度的增強，星形膠質細胞遷移能力也增強。在保證治療安全的前提下，本研究僅探討不同強度重復經顱磁刺激對腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的影響，對其余參數如頻率、刺激總量等對腦梗死治療的量效關系有待進一步基礎和臨床研究。